Сыворотку крови диких животных исследуют с лептоспирами 13–15 серогрупп.
В РМА используют эталонные штаммы лептоспир или их аналоги, рекомендованные Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов МСХ СССР.
Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов МСХ СССР, и поддерживают их периодическими пересевами через каждые 10 -15 дней.
Пригодность культуры для использования в реакции оценивают путем просмотра пробирок в проходящем свете и микроскопией.
При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в проходящем свете в среде хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании культуры посторонней микрофлорой, полная прозрачность среды – об отсутствии лептоспир.
В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5–15 дней без признаков агглютинации и лизиса (четкообразные, неподвижные клетки) с накоплением 70–100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 20X10X1,5 или 40X7–10. Культуры, содержащие 150–200 и более лептоспир в поле зрения микроскопа, разводят перед постановкой реакции питательной средой или физиологическим раствором до указанной концентрации.
Каждое разведение сыворотки разливают в отдельный ряд, состоящий из 5–13 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в три лунки с разными разведениями сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 30 °С в течение часа.
Контролем служит смесь культуры лептоспир с физиологическим раствором по 0,1 мл. Лептоспиры в контроле должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации.
4.1.8. Реакцию учитывают путем микроскопии капель из каждой лунки в темном поле микроскопа при увеличении 20X10 или 20X7X1,5. Капли из лунок выносят на предметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла. Капли можно наносить двумя способами: 1) бактериологической петлей диаметром 3 мм наносят на стекло сразу до 30 капель и затем просматривают их под микроскопом; 2) бактериологической петлей диаметром 1 мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зрения одну каплю и просматривают ее, передвигают столик на 2–3 мм и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. В этом случае на одном предметном стекле учитывают 60–80 капель.
После каждого антигена петлю прокаливают и охлаждают.
4.1.9. Результаты реакции оценивают в крестах по четырехбалльной системе:
+ + + +агглютинированы 100% лептоспир;
+ + + – агглютинированы 75% лептоспир;
+ + – – агглютинированы 50% лептоспир;
+ – – – агглютинированы 25% лептоспир;
– (знак минус) агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3–5 до нескольких десятков и даже сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность.
В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоопир, проявляющийся в набухании и обездвиживании, появлении зернистости и полного распада микробных клеток.
4.1.10. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста, при отсутствии агглютинации в 'контроле.
При повторном исследовании сыворотки крови реакцию ставят в тех же разведениях.
4.2. Порядок постановки и учета реакции макроагглютинации (РА)
Реакцию макроагглютинации ставят и учитывают в соответствии с Временным наставлением по применению антигенов для диагностики лептоспироза у животных реакцией макроагглютинации, утвержденным Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 12 мая 1974 года.
4.3. Оценка показаний РМА и РА
4.3.1. Животных с титром сыворотки в РМА 1: 100 или реагирующих по РА на 1–2 креста, кроме лошадей и крупного рогатого скота, реагирующих с лептоспирами группы Hebdomadis, считают подозреваемыми в заражении.
Крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis, и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серологической группы, считают подозреваемыми в заражении при титре антител в РМА 1: 500 или реагирующих в РА на 1–2 креста с неразведенной сывороткой.
Кровь от животных, подозреваемых в заражении, и от животных, не реагировавших при первом исследовании, повторно проверяют через 7–10 дней.
4.3.2. Выявление антител у животных, не реагировавших при первом исследовании, или нарастание титра у реагировавших в РМА в пять и более раз, или положительная РА на 3–4 креста свидетельствуют об активном инфекционном процессе у обследуемых животных.
4.3.3. Животных (кроме лошадей и реагирующего с лептоспирами группы Hebdomadis крупного рогатого скота) с титром сыворотки в РМА 1: 500 и более или в РА на 3–4 креста и крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серогруппы при титре в РМА 1:2500 и более или в РА на 3–4 креста, рассматривают как возможных лептоспироносителей.
4.3.4. Возбудителями лептоспироза при серологической диагностике считают лептоспир той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.
Необходимо учитывать, что в сыворотке крови свиней, крупного рогатого и мелкого рогатого скота и лошадей при исследовании по РМА обнаруживают в 5 – 15% случаев (из числа положительно реагирующих) антитела в наиболее высоком титре к лептоспирам Australis, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Bataviae, которые не были выделены ни в одном случае от сельскохозяйственных животных.
Такие реакции следует рассматривать как межгрупповые, являющиеся следствием заражения животных лептоспирами Pomona, Tarassovi и другими, обычно выделяемыми от сельскохозяйственных животных.
Лептоспиры Australis, Bataviae, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Kazachstanica могут быть признаны возбудителями лептоспироза у сельскохозяйственных животных только после выделения этих лептоспир в чистой культуре или подтверждении их роли реакцией иммуноабсорбции.
4.4. Методика постановки реакции иммуноабсорбции при исследовании проб сыворотки
4.4.1. В реакции иммуноабсорбции изучают пробы сыворотки животных, агглютинирующие лептоспиры нескольких серологических групп в равно высоких титрах или имеющие наиболее высокий титр – по отношению к лептоспирам, ранее не известным в качестве возбудителя лептоспироза у сельскохозяйственных животных.
4.4.2. Для проведения абсорбции выращивают в 0,2 – 0,5 – литровых флаконах все штаммы лептоспир, с которыми данная проба сыворотки дала реакцию агглютинации. К 5–7-суточным культурам добавляют 0,3% формалина и выдерживают 10–12 часов. Затем лептоспиры осаждают центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 минут. Сливают надосадочную жидкость, а осадок суспензируют в объеме 0,9 мл среды или физиологического раствора, 0,1 мл исследуемой сыворотки смешивают с 0,9 мл концентрированного антигена и выдерживают в течение 48 часов при температуре 1–5 °С. Абсорбированную сыворотку проверяют в РМА на наличие остаточных антител к штамму-абсорбенту, а затем исследуют с лептоспирами групп, с которыми реагировала сыворотка до абсорбции.
4.4.3. В процессе абсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем инфекции у данной особи, извлекают из сыворотки антитела к лептоспирам всех других серологических групп, в то время как антитела к штамму-возбудителю болезни не абсорбируются из сыворотки гетерологичными типами лептоспир.
Для сокращения объема работы сыворотку можно в начале абсорбировать лептоспирами, являющимися наиболее частыми возбудителями болезни у животных данного вида.
4.4.4. Оценка эпизоотической ситуации в хозяйстве по результатам лабораторных исследований приведена в Инструкции о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных пп. 2.4., 2.5. и 2.6.
| Серологическая группа | Серологический вариант | Типовой штамм |
| Icterohae-morrhagiae | icterohaemorrhagiae copenhageni mankarso naa'm mwogolo dakota sarmin birkini smithi ndambari ndahambukuje budapest weaveri | RGA M-20 Mankarso Naam Mwogolo Grand River Sarmin Birkin Smith Ndambari Ndahambukuje PV-1 GZ-390-U |
| Javanica | javanica poi sorex-jalna coxi sofia | Veldrat Batavia 46 Poi Sorex Jalna Cox Sofia 874 |
| Celledoni | celledoni whitcombi | Celledoni Whitcombi |
| Canicola | canicola bafani kamituga jonsis sumneri broomi bindjei schnueffneri benjamin malaya | Hond Utrecht IV Bafani Kamituga Jones Sumner Patane Bindjei Vleermuise 90-C Benjamin H-6 |
| Ballum | ballum castellonis arboreae | MUS-127 Castellon-3 Arboreae |
| Pyrogenes | pyrogenes Zanoni myocastoris abramis biggis hamptoni alexi robinsoni rnanilae | Salinem Zanoni LSU-1551 Abraham Biggs Hampton HS-616 Robinson LT-398 |
| Cynopteri | cynopteri canalzoniae butembo | 3522-C Cz-188k Butembo |
| Autumnalis | autumnalis rachmati fortbragg sumatrana bulgarica bangkinang erinaceiauriti mooris sentot louisiana Orleans djasiman gurungi | Akiyama A Rachmat Fort Bragg Sapulette Nikolaevo Bangkinang-1 Erinaceus auritus 670 Moores Sentot LSU-1945 LSU-2580 Djasiman Gurung |
| Australis | australis lora muenchen jalna bratislava fugis bangkok peruviana pina nicaragua | Ballico Lora Munchen C-90 Jalna Jez Bratislava Fudge Bangkok D-92 Lt-941 LT-932 Lt-990 |
| Pomona | pomona kennewieni monjakov mozdok tropika proechimys | Pomona Lt-1026 Monjakov 5621 CZ-299U LT-796 |
| Grippotypho-sa | grippotyphosa valbuzzi | Moskva-V Valbuzzi |
| Hebdomadis | hebdomadis nona kambale kremastos worsfoldi jules maru borincana kabura mini | Nebdomadis Nona Kambale Kremastos Worsfold Jules CZ-285– В HS-622 Kabura Sari |
| Hebdomadis | szwajizak georgia perameles wolffihardjo recreo medanensis trinidad seiroe balcanica polonica nero haemolytica ricardi | Szwajizak LT-117 Bandicoot-343 3705 Hardjoprajitno LT-957 Hond-HC LT-1098 M-84 1627 Burgas 493-Poland Qamsulin March Richardson |
| Bataviae | bataviaepaidjan djatzi kobbe balboa claytoni brasiliensis | Van Tienen Paidjan HS-26 CZ-320-K LT-761 LT-818 LT-996 |
| Tarassovi | tarassovi bakeri atlantae guidae kisuba bravo atchafalaya chagres rama gatuni | Perepelicin LT-79 LT-81 RP-29 Kisuba Bravo LSU-1013 LT-924 LT-955 LT-839 |
| Panama | panama | CZ-214-K |
| Sherman! | shermani | LT-821 |
| Semaranga | semaranga patoc sao-paulo | Veldrat Semarang-173 Patoc I Sao Paulo |
| Andamana | andamana | CH-11 |