1.11.5. Высевы от убитых и павших зверьков делают из сердца, печени и почки в 2–3 пробирки из каждого органа. Вторую почку, кусочки печени, транссудат из грудной и брюшной полостей, околосердечную жидкость и содержимое мочевого пузыря микроскопируют.
1.11.6. Культуры лептоспир чаще удается выделить из органов зверька в период проявления клинических признаков болезни, проявляющихся отказом от корма, вялостью, дрожью, взъерошенностью шерсти, конъюнктивитом, желтушностью видимых слизистых оболочек и т.д.
1.11.7. У крольчат и морских свинок проводят после заражения термометрию. У крольчат нормальной температурой считается 38,5–39,5 °С, у свинок – 38–39,5 °С. В период лихорадки кровь берут из уха или сердца шприцем для микроскопии и посева.
1.11.8. Патогенность и вирулентность выделенных культур лептоспир проверяют на золотистых хомяках или крольчатах. Патогенные лептоспиры способны размножаться в организме животного, вызывать клинические проявления болезни, характерные патологоанатомические изменения и гибель животного. Лептоспиры-сапрофиты такими свойствами не обладают. Заражение животных проводят внутрибрюшинно 5–7-дневной культурой, содержащей 70–100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Культуры лептоспир, убивающие золотистых хомяков на 5–12-й день дозой менее 0,1 мл, считают высоковирулентными, 0,2–0,4 мл – средней вирулентности и 0,5–1 мл – слабовирулентными.
1.11.9. Определение серогрупповой принадлежности культур лептоспир проводят в соответствии с Наставлением по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток, утвержденным Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 31 мая 1974 г.
1.11.10. В качестве биологической модели для обнаружения лептоспир могут быть использованы взрослые кролики и морские свинки. Кровь животных исследуют по РМА на наличие специфических антител. Животных, в крови которых не обнаружены специфические антитела, заражают исследуемым материалом.
Кровь зараженных животных исследуют три раза через каждые семь дней по реакции микроагглютинации начиная с разведения 1: 10 с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение в крови зараженных животных специфических антител свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемом материале и позволяет ориентировочно судить о их серогрупповой принадлежности.
2. Бактериологическое исследование воды
2.1. Вода является основным фактором в передаче возбудителя лептоспироза.
Лептоспир обнаруживают в воде биологической пробой на крольчатах, свинках, хомяках, 'крапчатых сусликах, взрослых кроликах, используя одну из следующих методик.
2.2. Пробы воды объемом 1–2 л берут в стерильную посуду, подогревают до 30° и выливают в эмалированный кювет, – помещают в него на один час двух подопытных животных. кожа брюшка или задние ноги которых скарифицированы, так чтобы скарифицированная поверхность была погружена в воду. Начиная с четвертого дня у крупных зверьков (крольчата, морские свинки) берут кровь из сердца с целью выделения гемокультур, исследуют микроскопически брюшной экссудат. Одного из мелких зверьков убивают. На 14–20-й день всех выживших животных также убивают. Патологический материал исследуют на наличие лептоспир. Кровь исследуют на РМА.
2.3. Пробу воды (до 500 мл) центрифугируют при 10–15 тыс. об/мин в течение 30 – минут, сливают надосадочную жидкость, а осадки из всех центрифужных стаканов суспензируют в стерильной – питательной среде для лептоспир или физиологическом растворе. Суспензию вводят внутрибрюшинно или подкожно хомякам по 0,5–1 мл, крольчатам и морским свинкам по 1–2 мл. В дальнейшем исследуют, как указано в п. 2.2.
2.4. Полученный после центрифугирования осадок подкожно вводят в дозе 2–3 мл взрослым кроликам, не имеющим в крови лептоспирозных антител,
Через 7–14 и 20 дней кровь кролика исследуют по РМА с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение специфических антител в титре 1: 10 и выше свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемой пробе воды.
3. Импрегнация гистологических срезов из органов серебром по левадити
3.1. Материалом для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени толщиной не более 1 см, консервированные 10%-ным раствором формалина.
Лептоспиры удается обнаружить с наибольшим постоянством в гистологических срезах импрегнированных серебром по Левадити. Методы Крантца, Полагута и Майера менее эффективны.
3.2 Несколько кусочков органов не толще 1 см, лучше 2–'3 мм, фиксируют в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина 24–48 часов. После фиксации кусочки переносят в 96° спирт на 24 часа. Промывают в дистиллированной воде до тех пор, пока кусочки не осядут на дно бюкса (не менее 2–3 часов), воду меняют три раза.
3.3. Помещают кусочки в 1–3%-ный раствор азотнокислого серебра на 3–6 дней. Процесс серебрения ведут при температуре 37 °С. Раствор азотнокислого серебра готовят на свежей дистиллированной воде из расчета 15 мл раствора на один кусочек.
3.4. Прополаскивают в дистиллированной воде в течение 2–5 минут. После промывки кусочки переносят в небольшую порцию редуцирующей смеси в отдельной чашечке на 2 минуты (раствор быстро темнеет) и затем помещают их в приготовленный перед употреблением основной редуцирующий раствор следующего состава: пирогалловая кислота – 4 г, дистиллированная вода – 100 мл, формалин чистый – 5 мл.
Раствор готовят из расчета 20–25 мл на один кусочек ткани. Восстановление обязательно проводят в банке из темного стекла.
3.5. Кусочки выдерживают в редуцирующей смеси 24–48 часов при комнатной температуре в темном месте или в банке из темного стекла.
Время выдержки контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12–16 часов во избежание передержания, так как срезы могут стать черными. Промывают в дистиллированной воде 1–2 часа.
3.6. Обрабатывают препараты последовательно спиртами: в 96° спирт (спирт 1) на сутки; в 96° спирт (спирт 2) на сутки; в 96° спирт (спирт 3) – на сутки; спирт-метил (спирты этиловый и метилсалициловый поровну) – до опускания кусочков на дно бюкса, а затем в метилсалициловый – до утра.
3.7. После этого перекладывают в кашу-парафин (ксилол и парафин поровну) на 30 минут при 57°; парафин 1 – на 60 минут при 57 °С; парафин 2 – на 60 минут при 57 °С.
Из быстро остуженного парафина вырезают блок с кусочком органа и наклеивают на деревянный кубик. Приготавливают тонкие срезы на санном микротоме и наклеивают на предметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10–15 минут в каждом и заключают под покровное стекло в канадский бальзам, подсушивают и просматривают под микроскопом со светлопольным конденсором при увеличении 90X7–10.
В случае неудовлетворительных результатов импрегнации лептоспир готовят препараты из других одновременно приготовленных блоков. Препараты необходимо хранить в темноте.
3.8. Микрокартина: лептоспиры черные, окружающая ткань буровато-желтая. Лептоспиры располагаются на поверхности эпителия и в просветах мочевых канальцев почек, несколько реже – в цитоплазме эпителия, преимущественно группами. После импрегнации серебром типичные лептоспиры имеют S-образную с 1–2 изгибами или змеевидную форму с грубыми, толстыми завитками, которые в отдельных случаях слабо заметны. Иногда в просвете и на поверхности эпителия мочевых канальцев встречаются аргирофильные гранулы (окрашены в цвет лептоспир), 'которые при отсутствии типичных форм нельзя принимать за лептоспир.
4. Серологическая диагностика лептоспироза
4.1. Серологическая диагностика лептоспироза основана на обнаружении специфических антител в крови животных, реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией микроагглютинации (РА).
4.2. Сыворотку крови животных исследуют на лепто-спироз по РМА или РА для выяснения благополучия хозяйства по этому заболеванию и установления диагноза на лептоспироз у отдельных животных.
В последнем случае проводят 2–3-кратное исследование. Кровь берут для исследования на 5–7-й день болезни и повторно через 7–10 дней.
4.1. Порядок постановки и учета реакции микроагглютинации (РМА)
4.1.1. Для постановки реакции микроагглютинации необходимы:
– исследуемая сыворотка крови животных;
– антигены – культуры диагностических штаммов лептоспир;
– электролит – физиологический раствор;
– микроскоп, конденсор темного поля и осветитель те же, что для микроскопической диагностики;
– агглютинационные пластинки или пробирки Флоринского;
– 40–100-гнездные штативы;
– бактериологические пробирки;
– градуированные пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл;
– аппарат Флоринокого;
– предметные стекла.
4.1.2. Исследуемая сыворотка. Для исследования пригодна сыворотка свежая, замороженная, высушенная на фильтровальной бумаге, консервированная фенолом или борной кислотой. Консервируют отстоявшуюся сыворотку, слитую в сухие стерильные пробирки.
Добавляют 5%-ный раствор фенола при постоянном помешивании 0,05 мл (1 капля) на каждый миллилитр сыворотки.
Борную кислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадать в пипетку во время постановки реакции.
Высушивают сыворотку на квадратах (5X5 см)' белой фильтровальной бумаги по 3–5 капель (0,05 мл каждая) при комнатной температуре или в термостате при температуре 37 °С. Консервированные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. Гемолизированные, загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют.
4.1.3. Антигены. В качестве антигенов в РМА используют живые культуры лептоспир различных серологических групп. Республиканские лаборатории ставят реакцию с лептоспирами 13 серологических групп: Icterohaemorrhagiae, Javanica, Canicola, Pyrogenes, Cynoptery, Autumnalis, Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Tarassovi, Bataviae, Australis, Ballum.
Краевые, областные, межрайонные лаборатории исследуют сыворотку домашних животных с антигенами 6 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Hebdomadis, Canicola.