В кислой моче с рН 5,0–6,0 лептоспиры быстро утрачивают подвижность и погибают. Некоторые мертвые клетки сохраняют форму, типичную для лептоспир, но у них по длине тела бывает видна зернистость, довольно часто концевые крючки распрямлены.
1.5. Микроскопия крови
1.5.1. Кровь, взятую от больного или подозреваемого в заболевании животного, смешивают с двойным количеством 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия, центрифугируют при 2–3 тыс. об/мин в течение 5 минут или отстаивают в течение часа, микроскопируют прозрачный надосадочный слой жидкости. Целесообразно осаждение лептоспир из надосадочной жидкости проводить центрифугированием при 10–15 тыс. об/мин в течение 30 минут.
1.6. Микроскопия суспензии из ткани органов
1.6.1. При бессимптомном течении лептоспироза суспензию готовят из кусочков коркового слоя почки, а при остром течении – из почки и печени. У абортированного плода микроскопируют 'Суспензию из всех органов.
1.6.2. Кусочки исследуемого органа весом 2–3 г. растирают в ступке с 5–7 мл питательной среды, физиологического раствора или стерильной воды до получения гомогенной взвеси. Суспензию отстаивают в холодильнике 1–2 часа или центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут и микроскопируют надосадочную жидкость.
1.6.3. Транссудат из грудной и брюшной полостей, околосердечную жидкость, содержимое желудка плода и другие жидкие субстраты микроскопируют по той же методике, что и мочу.
1.6.4. Из проб крови и суспензии каждого органа готовят не менее трех раздавленных капель и просматривают в каждой из них не менее 50 полей зрения
1.7. Дифференциальная диагностика
1.7.1. При микроскопической диагностике лептоспиры необходимо дифференцировать от нитей фибрина, обломков хвостовых частей спермиев, разрушенных эритроцитов, спиралло- и вибриоподобных микроорганизмов, интерспир у хряков и других микроорганизмов.
1.7.2. Спермии постоянно содержатся в моче быков и хряков и часто в большом количестве. Обломки их хвостовых частей не имеют концевых крючков, неподвижны и вследствие преломления света кажутся блестящими.
1.7.3. Нити фибрина постоянно обнаруживают в крови, транссудате и иногда в «моче. Они не преломляют свет, но не имеют концевых крючков и не обладают подвижностью.
1.7.4. Содержимое эритроцитов может выдавливаться через поры мембраны в виде тонких нитей. Такой эритроцит очень напоминает «паучок» из агглютинированных лептоспир. Свободный конец каждой нити под действием тока жидкости непрерывно извивается и колеблется. Часть нитей отрывается от эритроцитов и очень напоминает по форме и размерам лептоспир, но в отличие от последних они тоньше, не имеют крючков и не способны самостоятельно двигаться.
1.7.5. Спирилла- и вибриоподобные микроорганизмы обнаруживают в 10–15% случаев в моче свиней и крупного рогатого скота и постоянно – в крови, спинномозговой жидкости, суспензии из органов, а также в тканях и жидкостях абортированных плодов. Эти микроорганизмы отличаются от лептоспир змееподобным движением и отсутствием концевых крючков.
1.7.6. Интерспиры обитают в препуциальном мешке свиней. В моче, взятой при естественном мочеиспускании, их обнаруживают повсеместно в 50–80% случаев. В моче, взятой из мочевого пузыря, они не содержатся. Интерспиры подвижны. Оба или один конец микробной клетки перемещается судорожными, маятникообразными с широкой амплитудой движениями. После нескольких колебательных движений клетка некоторое время остается неподвижной, а затем снова можно наблюдать несколько очередных движений. Подвижность сохраняется не более 1–2 часов с момента получения мочи. Неподвижная интерспира имеет, так же как и лептоспира, один или два крючка и не преломляет свет, но в отличие от лептоспир у шее видны первичные завитки и тело клетки запоминает нить, состоящую из бусинок. Концы крючков заострены.
1.7.7. Другие микроорганизмы дифференцируют от лептоспир по форме и характеру движения, и все они, кроме того, преломляют свет и кажутся блестящими.
1.8. Выделение культур лептоспир
1.8.1. Выделение лептоспир из крови при жизни возможно в первые 5–7 дней болезни в период лихорадки. Для этой цели кровь из яремной или ушной вены вносят через стерильную иглу по 3–5 капель в 5–7 пробирок с питательной средой или высевают из пробы крови, присланной в лабораторию (приложения 2 и 3).
1.8.2. От трупа при диагностическом убое высевают пастеровской пипеткой кровь из сердца, ткани печени и почки, а от абортированного плода, кроме того, и из содержимого желудка. При убое клинически здоровых животных высевы делают из почки и мочевого пузыря. Из каждого органа засевают 3–5 пробирок с питательной средой.
1.8.3. Для выделения культур из почки ее освобождают от капсулы, поверхность прижигают шпателем или горящим спиртовым тампоном, пипетку вводят параллельно поверхности в корковый слой. Высев делают у крупного рогатого скота из 2–3 долей почки, у свиней– из нескольких участков почки.
1.8.4. Высевы из других органов делают по общепринятой методике.
Мочу, ликвор, околосердечный, брюшной транссудат и другие жидкие биосубстраты засевают по 1–3 капли в 3–5 пробирок с питательной средой.
1.8.5. Посевы культивируют при температуре 28 – 30° в течение трех месяцев. Лептоспиры, размножаясь в питательной среде, не изменяют ее внешнего вида. Поэтому для выявления роста лептоспир через 3, 5, 7, 10 и далее каждые 5 дней культивирования из всех пробирок микроскопируют капли, которые наносят на предметное стекло бактериологической петлей. Большинство культур вырастает через 7–20 дней. Иногда лептоспиры обнаруживают в среде на 3–5-й день, через 1–2 месяца и очень редко через 2–3 месяца культивирования.
Содержимое Каждой пробирки, в которой обнаружены лептоспиры, пересевают в 3–5 пробирок со свежей питательной средой. Пробирки с обильным ростом посторонней микрофлоры уничтожают.
1.9. Порядок сохранения культур
1.9.1. Пересевы культур лептоспир производят пастеровскими пипетками. В пробирку с 5–10 мл питательной среды вносят 0,5–1,0 мл культуры. Максимальное накопление лептоспир наблюдается через 4–7 дней культивирования при температуре 28–30°.
1.9.2. Рост и чистоту культуры лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопически в темном поле микроскопа и макроскопически – просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При этом после встряхивания в питательной среде четко просматриваются муаровые волны, образуемые выросшей культурой.
Культуру лептоспир пересевают через каждые 10–15 дней не менее чем в 3–4 пробирки.
1.9.3. Штаммы лептоопир, постоянно поддерживаемые б лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом, в запаянных ампулах, в морозильной камере при –70–80 °С или при температуре жидкого азота (–190 °С). Лептоспиры консервируют любым из этих методов после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления.
В пробирку на культуру наслаивают 1 – 1,5 мл стерильного вазелинового масла или культуру расфасовывают в стерильные 1–5 мл ампулы из нейтрального стекла и запаивают.
Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение трех месяцев.
1.9.4. Для хранения в замороженном состоянии культуры расфасовывают в ампулы, запаивают, охлаждают до 0–4 °С и помещают в сосуды Дьюара, заполненные азотом, или морозильную камеру.
В жидком азоте лептоспиры можно хранить без пересевов в течение года, при этом они заметно не изменяют своих биологических свойств.
1.10. Очистка загрязненных культур лептоспир
1.10.1. Культуры лептоспир, загрязненные микрофлорой, очищают биологическим методом, фильтрацией через бактерийные фильтры или пересевом на плотные питательные среды.
1.10.2. Для очистки биологическим методом загрязненную культуру вводят внутрибрюшинно морским свинкам в дозе 1–2 мл, крольчонку – 1–2 мл, хомяку или мыши – 0,5 мл. Через 30–60 минут кровь из сердца зараженного животного высевают в пробирки с питательной средой.
1.10.3. Лептоспиры проходят через асбестовые фильтровальные пластины марки СФ и свечи Шимберляна Л-5. Для очистки методом фильтрации загрязненную культуру фильтруют через простерилизованный фильтр. Фильтрат рассеивают в 5–10 пробирок с питательной средой. В высевах из фильтрата получают чистую культуру лептоспир.
1.11. Постановка биологической пробы
1.11.1. Восприимчивы к лептоспирозу при экспериментальном заражении золотистые хомяки, крольчата, морские свинки, крапчатые суслики, щенки собак, котята, белые и серые мыши.
Для повседневной практической работы используют золотистых хомяков 20–30-дневного возраста и крольчат-сосунов в возрасте 10–20 дней.
Молодые свинки (3–5-недельного возраста) весом 150–200 г. наиболее чувствительны к L. icterohaemorrhagiae, в меньшей степени – к L. pomona и мало чувствительны к лептоспирам других серологических групп.
1.11.2. Лабораторных животных заражают для выделения культур лептоспир из патологического материала и объектов внешней среды, очистки культур лептоспир от посторонней микрофлоры, определения вирулентности выделенных культур и дифференциации от сапрофитов.
1.11.3. Для выделения культур лептоспир животных заражают кровью, мочой, суспензией из паренхиматозных органов животных (абортированного плода) или спермой.
Исследуемый материал вводят подкожно или внутрибрюшинно хомякам от 0,3–0,5 до 1 мл, крольчатам – 2–3 мл.
1.11.4. На каждую пробу исследуемого материала необходимо брать по два зверька: одного из них убивают на 4–5-й, другого, если он не погибает, на 14–16-й день после заражения. Кровь зверька, убитого на 14–16-й день после заражения, исследуют по реакции микроагглютинации, начиная с разведения 1:10 с лептоспира-ми 13 серологических групп. Положительная РМА свидетельствует о наличии лептоспйр в исследуемом материале.