Фрагменти ПЛР позитивного зразка від мотиля клонували у плазмідний вектор та визначали їх нуклеотидну послідовність. На підставі трьох сіквенсів ізоляту пташиного грипу був проведений філогенетичний аналіз. У подальшому, використовуючи веб-браузер BLAST-P, проведено пошук по базах даних GenBank, EMBL, BDBI та PDB, найбільш споріднених до визначеного нами фрагмента вірусу пташиного грипу, амінокислотних послідовностей інших ізолятів вірусу.
Таблиця 2 – Дослідження матеріалу із ставів оз. Сиваш на наявність вірусу високопатогенного грипу H5N1
| №п/п | Характеристика проби | Методи дослідження | |||
| титру РГА | титру РЗГА(Н5) | ПЛР в режимі реального часу, A/H5N1 | зараження курячих ембріонів 10-добового віку | ||
| 1 | Проба мотиля, листопад, 2006 рік | НД | НД | + | |
| Алантоїсна рідина курячих ембріонів – І пасаж, 3 ембріони | 1:256 | 1:64 | + | Загибель на 3 добу | |
| Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІ пасаж, 5 ембріонів | 1:256 | 1:64 | + | Загибель на 3 добу | |
| Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІІ пасаж, 5 ембріонів | 1:256 | 1:64 | + | Загибель на 3 добу | |
| 2 | Проба мотиля,квітень, 2007 рік | – | НД | + | Загибель не відбулась |
| Алантоїсна рідина курячих ембріонів – І пасаж, 7 ембріонів | – | НД | – | Загибель не відбулась | |
| Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІ пасаж, 5 ембріонів | – | НД | – | Загибель не відбулась | |
| Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІІ пасаж, 5 ембріонів | НД | НД | – | Загибель не відбулась | |
| 3 | Проби мулу, став Любимівка, оз. Сиваш | – | НД | + | |
| 4 | Алантоїсна рідина курячих ембріонів – І пасаж, 5 ембріонів | – | НД | – | Загибель не відбулась |
| 5 | Проби пеленгаса, став Костин Шпиль, оз. Сиваш | – | НД | + | Загибель не відбулась |
| 6 | Проби креветок, став Костин Шпиль, оз. Сиваш | НД | НД | – | |
Примітки: 1. У цій та наступних таблицях: (+) – позитивний результат дослідження; (–) – негативний результат дослідження;
2. НД – матеріал не досліджували.
На підставі одержаних результатів були побудовані філогенетичні дерева і встановлено наявність нового ізоляту штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H5N1)”. З’ясувалось, що цитопатична дія нового штаму (визначали шляхом зараження моношарових культур фібробластів ембріонів курей) проявлялась через 48 годин та завершувалась впродовж 72-х годин. Титр вірусовмістимої рідини штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H5N1)” на культурі курячих фібробластів становив 105,9ЦПД 50/0,1см3, а на курячих ембріонах − 108,45ЕЛД 50/0,1см3.
Зміни гістоструктури курячих ембріонів, заражених вірусом грипу штаму “А(chironomida)Azov/11/2006/(H5N1)”. Встановлено, що виділений нами штам “А(chironomida)Asov/11/2006 /(H5N1)” у трьох проведених пасажах на курячих ембріонах проявляє цитопатогенну дію і зумовлює загибель ембріонів через 48 годин. Патогенна дія у ембріонів проявляється ураженнями головного та спинного мозку, мозкових оболонок, що формуються, та ендотелію кровоносних судин, які мають запальний характер. Також відмічається розвиток жирової дистрофії гепатоцитів та зернистої дистрофії нефроцитів.
Одержані результати прояву патогенної дії підтверджують належність цього штаму до високопатогенного вірусу грипу птахів.
Морфофункціональні зміни в організмі риб, заражених вірусом грипу штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H5N1)”. Після введення коропам у черевну порожнину вірусовмістимого матеріалу, відібраного від мотиля, впродовж всього досліду загибелі риб не реєстрували, а також були відсутні клінічні та патолого-анатомічні ознаки захворювання (табл. 3).
Таблиця 3 – Виявлення присутності вірусу та визначення вірусної активності в гомогенатах тіла коропів
| Строки відбору проб, діб | Кількість введеного вірусовмістимого матеріалу, см3 | Методи дослідження | Результати інфікування курячих ембріонів | |||
| РГА | РЗГА | ПЛР | ||||
| Через 1 | 0,1 | + | + | + | Загибель на 3 добу | |
| 0,2 | + | + | + | |||
| Через 2 | 0,1 | – | – | + | Загибель на 3 добу | |
| 0,2 | + | + | + | |||
| Через 3 | 0,1 | – | – | + | Загибель на 3 добу | |
| 0,2 | – | – | + | |||
| Через 5 | 0,1 | – | – | – | Загибель відсутня | |
| 0,2 | – | – | – | |||
| Через 10 | 0,1 | – | – | – | Загибель відсутня | |
| 0,2 | – | – | – | |||
Зразками гомогенатів від позитивних у ПЛР риб були заражені 10-добові курячі ембріони. Загибель курячих ембріонів реєструвалась через 3 доби. Після утримання інфікованих риб і подальшому відборі з них через 5−10 діб патологічного матеріалу та його інокуляції не відмічали загибелі ембріонів, і не було встановлено наявність вірусу за допомогою ПЛР. Як видно з табл. 3, в організмі коропа патогенний вірус грипу птахів зберігався протягом 3-х діб.
За період проведення експериментів (10 діб) не спостерігалось достовірного зниження маси, довжини, вгодованості, морфологічних та біохімічних показників крові (еритроцити, лейкоцити, вміст білка та лізоциму в сироватці) в дослідних групах риб порівняно з контрольними особинами. Той факт, що в організмі риб достовірно (Р<0,05) підвищилися бактеріцидна активність сироватки крові та вміст лізоциму у відповідь на інокуляцію вірусу, свідчить про їх стійкість до цього патогену. Очевидно, риби можуть бути резервуаром збудника пташиного грипу та брати участь у формуванні водних природних вогнищ цієї хвороби.
Медична п’явка – можливий резервуар та біотранспортер вірусу грипу птахів. Нами встановлено, що вірус пташиного грипу, інокульований у п’явку, здатний зберігатись у ній впродовж 45 діб та проявляти високу патогенність. Зниження інфекційної активності та виживання вірусу пташиного грипу залежить від його концентрації та часу перебування в організмі п’явки (табл. 4).
Таблиця 4 – Експериментальне зараження медичної п’явки вірусом пташиного грипу та курячих ембріонів
| Час досліджень | Титри вірусовмістимої рідини | Результати дослідження методом ПЛР | Зараження10-добових курячих ембріонів |
| Групи | |||
| 5 діб | |||
| 1 група | 108,45 ЕЛД50/0,1см3 | + | Загибель на 2 добу |
| 2 група | 107,45 ЕЛД50/0,1см3 | + | Загибель на 2 добу |
| 3 група | 106,45 ЕЛД50/0,1см3 | + | Загибель на 4 добу |
| 4 група | 105,45 ЕЛД50/0,1см3 | + | Не загинули |
| Контроль | 0,9 % р-н NaCl | – | Не загинули |
| 45 діб | |||
| 5 група | 108,45 ЕЛД50/0,1см3 | + | Загибель на 3 добу |
| 6 група | 107,45 ЕЛД50/0,1см3 | + | Загибель на 3 добу |
| 7 група | 106,45 ЕЛД50/0,1см3 | – | Не загинули |
| 8 група | 105,45 ЕЛД50/0,1см3 | – | Не загинули |
| Контроль | 0,9 % р-н NaCl | – | Не загинули |
Так, через 5 діб після інокуляції вірусної суспензії в титрах 108,45 ЕЛД50/0,1см3 , та в розведені 1:10 (107,45 ЕЛД50/0,1см3), 1:100 (106,45 ЕЛД50/0,1см3) та 1:1000 (105,45 ЕЛД50/0,1см3) відповідно спостерігали загибель курячих ембріонів на 2–3 добу. В розчині 1:1000 хоч і була виявлена позитивна ПЛР, але не відбувалось загибелі курячих ембріонів. Через 45 діб суспензії п’явок викликали загибель курячих ембріонів на 3-ю добу (нерозведений та розведений 1:10 матеріал відповідно).
Таким чином, виділено новий високопатогенний штам “А(chironomida) Azov/11/2006/(H5N1)”, який викликає загибель курячих ембріонів через 48 годин, а також зумовлює ЦПД у культурі курячих фібробластів. Цей штам до 3-х діб зберігається в організмі риб і до 45 діб – в організмі п’явок, не втрачаючи вірулентності, його було депоновано нами в ДНКІ БШМ з метою використання при створенні сучасних засобів діагностики та профілактики високопатогенного грипу птахів.
Розробка інтегральної системи контролю за спалахами пташиного грипу в Україні. Розроблена і впроваджена електронна інтегральна система контролю за спалахами пташиного грипу в Україні. В її основу було покладено результати наших власних досліджень і спостережень, а також результати аналізу відповідних літературних повідомлень щодо проблеми ортоміксовірусної інфекцій в гуманній і ветеринарній медицині. При розробці та організації протиепізоотичних заходів проти грипу птахів слід розрізняти епізоотичний осередок, неблагополучний пункт, зону загрози і зону нагляду. Глибина зони нагляду становить не менше 10 км від меж неблагополучного пункту. Розроблена нами інтегральна електронна система контролю за спалахами пташиного грипу в Україні дозволяє в будь-який час визначити межі епізоотичного вогнища, межі неблагополучного пункту, зону загрози, зону спостереження та проводити в них належні заходи діагностики, профілактики, оздоровлення від грипу птахів. Також електронна інтегральна система передбачає процедуру зняття карантину, обмежувальних заходів та захист персоналу, задіяного в проведенні спеціальних заходів щодо ліквідації захворювання птахів на грип.