Однак події вже набрали необоротного характеру: король своїм универсалом підтримав справу унії, а Потій і Терлецький відбули до Риму, де 23 грудня 1595р. склали присягу Папі. Заключний акт укладення унії мав відбутися на соборі в Бересті (нині м. Брест), призначеному на 6 жовтня 1596р. Никифор запросив на нього Кирила Люкариса, протосінкела Алесандрійського патріярха, кількох грецьких єпископів, митрополита Білгородського. З українськими владиками, з’явились католицькі єпископи, четверо видніших ієзуїтських проповідників, крім того воєводи.
На боці православних були: два єпископа - Гедеон Львівський та Михаїл Перемиський, які розірвали з уніею, протосінкели Царьгородський та Александрійський, ігумени, понад 200 осіб білого духовенства, Сербський митрополит Лука; воєводи: Київський – князь Костянтин Острозький, Волинський – Олександр Острозький також депутати шляхти воєводств, міщани. Князь Острозький привіз з собою військо, що охороняло будинок Райського, де засідав Православний Собор. Прихильники унії зібралися в церкві св. Миколая.
Православні засідали за грецьким звичаем: миряни та духовні окремо. Три прохання Православного Собору до владик - насамперед до митрополита Михаїла Рогози прибути на Собор - залишилися без відповіді. Справ була тяжка: об’єднати ці дві частини Собору було неможливо - насамперед через участь Никифора та інших греків, яких король наказав арештувати і яких охороняв князь К. Острозький. Не погодилися приєднатися й православні до католицької частини Собору, не зважаючи на намовлення королівських послів. Так постало два Собора.
9жовтня 1596 року Никифор з хрестом і Євангелією в руках проголосив декрет, яким позбавляв митрополита Михаїла Рогозу та пять єпископів - Володимірського, Луцького, Полоцького, Холмського та Пинського - їх сану за самовільне піддання Папі. Цей декрет підписали духовні члени Собору і надіслали митрополитові Рогозі.
Уніятський Собор затвердив акт об’єднення церков та утворення греко-католицької церкви, яка підпорядковувалась Папі Римському. Було визнано основні догмати Католицької церкви, водночас церковні обряди залишились православними, а церковно-словянська мова - мовою богослужіння.
Православний собор не визнав правомірність рішення уніятів. Усі спроби примирення були марними: незабаром сторони прокляли одна одну. Так Украіна поділилась на дві частини. По одному боці став увесь православний загал і два владики, по другому - уніяти: митрополит, пять владик і купка крилошан.
Берестейська унія не внесла спокою і не поєднала Церков. Навпаки, крім двох - православної і католицької - з’явилась третя, уніятська. Передовсім завязалась гаряча литературна полеміка між православними та уніятами. Збоку католиків виступив першим Петро Скарга, який у 1597році видав книгу '‘Описаніє і оборона собору руського Берестейського” польською та українською мовами., обороняючи унію з каноничного погляду й доводячи, що православний Собор в Бересті був юридично неправомочний. На це православні зараз же відповіли виданням у Кракові в тім же році книга “Єктезіс” - акти Берестейського Собору з докладним, спокійним викладом його історії в протоколах і документах. Метою книжки було довести каноничність Православного Собору. Слідом за “Єктезісом” вийшла праця Христофора Філалета під назвою “Апокризис”. Трактат цей не лише змістом, але розміром - 334 сторінки - бере гору над усіма полемічними творами того часу.
Одночасно виступив полеміст не меншого таланту, але іншої ідеології, Іван Вишенський з Судової Вишні в Галичині. Він багато років перебував у манастирі на Афоні, звідки писав свої з0апальні, блискучи проповіді. Вишенський гостро виступав проти вищої ієрархії, що привела до унії, а також проти католицької та західньої культури. Він був прихильником старовини, не визнавав сучасної науки, поступу. Іван Вишенський написав багато трактатів проти унії, з них найсильнішим є “Писаніє к утекшим от православної віри єпископам”, написане десь біля 1597 року як відповідь на книжку Скарги. Воно дає надзвичайно гостру, убивчу оцінку унії. Він з обуренням виступє проти тих владик, які с презирством ставилися до “простаків”, хлопів.
Видатним полемістом був Мелетій Смотрицький, який студіював в Острозі, Вільні, в університетах Західньої Європи. Твір його - “Тренос албо плач Єдиної Вселеньскої Апостольскої Східньої Церкви” вийшов у 1610 році. Автор в глибоко ліричному тоні висловлює сум з приводу смерті К. Острозького (1608р.) та занепаду Православної Церкви. Твір справляв таке сильне враження, що Сігізмунд III наказав його знищити.
Єдиним міцним опонентом на твори православних був Іпатій Потій, який виступив спочатку з листом проти князя К. Острозького.На цей лист, з доручення князя, відповів “острозький клірик” з уїдливою дискридитацією Флорентійської унії. Потій відповів анонимним трактатом проти “Апокризиса” українською мовою 1598 р.
Полеміка після Берестейського Собору мала величезне значення тому, що вона уточнила характер, глибину розходження між православ’ям та католицизмом, а також протестантизмом. Хоч більша частина праць залишилася недрукованою, їх переписували, передавали з рук до рук, читали на великих зібраннях.
Велике напруження викликала в Україні справа переходу на новий календарний стиль. Року 1582 папа Григорій XIII, на підставі ухвали Нікейського Собору, наказав виправити старий Юліянський календар, в якому внаслідок недокладності числення зайшла різниця між каледарним та астрономічним часом. Пап наказав з 5 лютого 1582 року додати 10 днів. Цю реформу в протестанських та православних країнах зустріли вороже і навіть чимало католиків не прийняли їі.
Ян Лятос, астроном, очолив боротьбу проти нового стилю. Проти цього стилю висловився й Собор, скликаний патріярхом Єремією. Так стався поділ населення Польщі: католики прийняли новий стиль, а православні залишили старий. Зміна календаря викликала багато надуживань: дідичі забороняли селянам відзначати свята за старим стилем і змушували їх в ті дні працювати. Це додавало ще більше роздратування, збільшувало антагонизм (М. Грушевський).
Поруч литературної полемики велася й цілком реальна боротьба. Перш за все мало значіння те, що польське правительство визнавало за легальну віру тепер тільки унію. Воно почало з репресій проти Никифора - його відвезли до Марієнбургської фортеці, тримали його у вязниці, доки він там не помер.
Слабого митрополита Михаїла Рогозу замінив у 1600 році єпископ Володимирський, талановитий Іпатій Потій, що був до того Володимирським старостою, людина з великими зв’язками, добрий промовець і дипломат. Він повів рішучу боротьбу за переведення унії в життя. Потій почав переслідувати непокірних ігуменів і священників, одбирати у православних монастирі й друкарні, засновувати уніятські школи. Православна церква впадала в стан повної дезорганізації, яку зручно використовували прихильники унії.
На той час православне духовенство не мало рівного митрополитові Потієві, але мало князя Острозького, який останні роки свого життя присвятив боротьбі з унією та обороні Православної Церкви. Шукаючи підтримки, князь зблизився з кальвіністами. В 1599 році у Вільні відбулася Генеральна Конференція, на якій він заступав православну шляхту, а князь М. Радзівілл - кальвінистичну. Але співпраця двох конфесій не наладналась, бо духовні кола вороже поставилися до кальвіністів.