Завданням церковних братств було дбати про зовнішній порядок у храмі, про задоволення його матеріяльних потреб, піклуватися про хворих. Члени братства платили внески, на які влаштовувано свята - “кануни”. Згодом вони розширили свої завдання: допомагали членам, які попали в біду; виступали перед судами і самим королем в обороні Православної Церкви; брали участь у спробах відновити єпископію у Львові. Бачачи занепад освіти, братства стали організовувати братські школи. Особливу славу здобули школи Львівського та Київського братств.
Братства спочатку були переважно організаціями міщан, але поволі набули всестанового характеру. Більшість членів Луцького братства були шляхтичами, а в Київському було багато духовенства. Братства рішуче виступали проти патронату, проти польсько-католицької пропаганди, проти національних і религійних обмежень українців, проти ненормального життя духовенства, намагаючись впливати на висвячення гідних пошани людей. Таке “втручання”світських людей, міщан у церковні справи й прерогативи єпископів викликало з їх боку невдоволення .
У1586р. приїхав в Україну Антіохійський патріярх Йоаким і братчики звернулися до нього за порадою. Ознайомившись з непорядками в Православні Церкві та заходами братчиків для оздоровлення Церкви, він не тільки благословив їх, але й в грамоті своїй дав низку порад та доручень. Львівське братство мало стати зразком для інших братств. Мало стати центром організації, яка охоплювала всю Україну. Йому надано право контролювати моральність членів і навіть право відлучати їх від Церкви. Воно мало право слідкувати не тільки за своїми членами, а й за духовенством включно з митрополитом та єпископами. Щоб жили і служили вони Церкві згідно з апостольськими правилами. Царьгородський патріярх Єремія підтвердив 1589 року розпорядження Йоакима і затвердив права братств на духовну цензуру Церкви. Під час своєї подорожі по Україні патріярх рішуче став на боці братств, деградував Онисифора Дівочку і ряд неправно поставлених священників.
Діяльність братств була кроком революційним і, природно,. викликала, як згадано вище, незадоволення владик, яке підсилювалося іноді не зовсім тактовними акціями братчиків. Деякі з владик в гострій формі висловлювали своє обурення. Особливо Гедеон Балабан, єпископ Львівський, мав гострі конфлікти з братчиками.
Говоря про занепад Православної Церкви в Україні, не можна забувати того, що, після величезного піднесення, поступово занепадала й Католицька Церква. Ряд негідних свого становища пап підривали пошану до папства взагалі; до того додати появу на папському престолі пап та антипап, які поборювали один одного. Розкішне життя кардиналів та єпископів, які в Німеччині були одночасно світськими володарями, такі компромітуючі явища, як симонія - продаж церковних катедр, індульгенція, що пізніше стала оплатою за відпущення гріхів - все це підривало велич та могутність Католицької Церкви.
Сильнішим і небезпечнішим для Православної Церкви був вплив німецької реформації. Ще в XVст. Краків став осередком гуманістичних ідей, які ширилися в Італії та Німеччині. Видатні німецьки гуманісти - Цельтес, Бебель та інші - працювали в Кракові, куди приїздила вчитись українська молодь. Двір королеви Бони був притулком гуманистів і сприяв ширенню їх ідей. Другий шлях ішов безпосередньо з Німеччини через Кенісберг, Гданськ, Торн, де друкували лютеранські твори не тільки німецькою, але й польськими мовами. В Україні та Литві ширилися протестанські вчення переважно лівих - антитрінітаризму, кальвінізму, соцініянства. Назагал протестанські рухи не мали глибого впливу в Україні: приєдналася до них лише невелика група аристократії, переважно одного покоління, бо діти здебільшого відійшли від тих рухів. У народні глибині ці вчення не просякли. М. Грушевський нараховував, що в часи найбільших успіхів протестанти мали коло ста осідків.
Незважаючи на свою ослабенність, православ’я змогло прийняти виклик польського католицизму. Невилика купка українських магнатів, що лишались відданими давній вірі засновували православні школи та друкарні. У 1568р. Григорий Ходкевич надав притулок у своєму маєтку в Заблудові, що в Білорусії, Івану Федорову - друкарю, якого вигнали з Москви за спроби використати нову технику книго-друкарства. Іван Федорович у 1573 році переніс свою друкарню до Львова. Першою книгою, яку надрукував він у 1574р., був Апостол. Однак, незабаром він заборгувався, і кредитори забрали його підприємство за борги. Львівське братство викупило його в 1578 році. Констянтин Острозький засновує у своєму маєтку на Волині друкарню, якою керував Іван Федоров. Він надрукував коло 30 видань, серед них славетну Біблію. Це була перша повна Біблія, друкована слов’янською мовою. Історія цієї Біблії така. Князь Острозький, захоплений ідеєю оборони православної віри, вірішив видати повний текст Біблії, акого тоді не мав жодний з православних народів. Православні користувалися рукописними зошитами окремих частин Біблії, в яких було чимало помилок. Отже треба було насамперед мати вірний текст Біблії. В основу праці покладено текст 70 “толковників” - грецький переклад, а не гебрейський оригінал, при тому порівнювано його з іншими слов’янськими текстами .В 1581 році Біблія вийшла в світ. Звичайно вона мала недоліки, які пояснюються загальним станом освіти, неможливостю зібрати більше матеріялів тощо. Але в цілому це була видатна подія в історії української культури. Організація цієї величезної праці над текстами Біблії вимагала високосвічених учених, яких князь К. Острозький стягав з різних земель. 1583 року просив він папу вислати до нього вчених греків; шукав їх в Греції..
Десь наприкінці 1582року І. Федорович переїхав знову до Львова, де заходився організовувати нову друкарню. Року 1583 він помер. Його спадкоємці - Сенько Корунка та Сачко Сідляр - не змогли продовжувати справу і продали друкарню в 1588 році віленському друкареві Кузьмі Мамонечеві.
Крім друкарень в Острозі, Львові, Вільні, були друкарні у Стрятині, Рогатині, Крилосі, Угорцях, але існували вони недовгий час і не могли рівнятися своїм значенням зі львовською та острозькою. Існували також “мандрівні” друкарні, які належали приватним особам, що перевозили їх з місця на місце.
Князь Острозький заснував школи в Турові, Володимирі. А близько 1580р., зібрав значну групу вчених, відкрив Острозьку Академію. Вона включала грецьку, латинську, церковно-слов’янську, а також “сім вільних наук”, що поділялися на тривіум, який складався з граматики, риторики та діалектики (мистецтва диспуту), та квадріум, куди входили арифметика, геометрія, музика й астрономія. На чолі Академії стояв Герасим Смотрицький, шляхтич з Поділля; сред професорів були греки - Кирило Лукаріс, Никифор, Діонісій Палеолог; ієромонах з Острога Кіпріян, що вчився в Венеції; математик та астроном Ян Лятос, поляк, що раніше був професором Краківського університету; острозькі священники - Дем’ян Наливайко, редактор та перекладач кількох збірок; Василь. Були й світські люди. Серед цього гуртка були люди різних світоглядів: були й перейняті протестанськими поглядами, як Філалет; католики як Лятос; і православні. З Острозької Академії вийшло чимало видатних людей: Мелетій Смотрицький, син ректора, майбутній гетьман Сагайдачний. Своєрідну естафєту Острозька Академія передала братським школам, перша з яких виникла у 1586 р. у Львові. Виховання мало церковний характер; викладали слов’янську та грецьку мови, а також “вільні науки”:“тривіум” та “квадріум”. Для вчителя всі учні мали бути рівні, діти багатих і сиріт, і ті що “по вулиці ходять поживи просити”. Школа. Львівського Успенського братства служила зразком для ряду інших шкіл у Галичині, Рогатині, Стрию, Миколаєві, Перемишлі, Ярославі, Холмі, Володимирі, Луцьку та ін.
Найбільшого розвитку досягає шкільництво на переломі XVI-XVII ст. Братські дидискали, студенти і бурсаки дали нове, виховане не в атмосфері боротьби, покоління. Вихованці братських шкіл, шукаючи заробітку, мандрували по селах, містах, розносячи знання і гасла боротьби проти католицького наступу. Українська молодь не обмежувалась місцевими школами. Багато шляхетських дітей їздило до чужеземних университетів - до Кракова, Праги, Падуї, Віттенбургу, Галле, Парижу. Встановлювався та міцнішав культурний зв’язок України з Заходом. Під впливом реформації в Литовсько-Руському Князівстві ширяться переклади св. Письма українсько-руською мовою. Найвидатніша пам’ятка перекладної литератури - це т. зв. Пересопницька Євангілія, що її переклав з болгарської мови у 1556-1561 роках Михайло Васильєвич, син сяноцького протопопа. Її мова зближена до народньої і дає комбінацію елементів слов’янских з українськими.
Вплив гуманізму відбився на збільшенні інтересу до природничих наук, математики, астрономії. Ширилися філософські твори, головним чином античних філософів. Хоч і не безпосередньо, мав вплив на розвиток думок Максим Грек. Його листи поширював князь Андрій Курбський, що утік від Івана IV Лютого на Волинь. Перебуваючи у Миляновичах, на Ковельщині, Курбський перекладав твори грецьких авторів, писав філософський трактат. Вихованого в дусі “книжності”, його вразило становище Православної Церкви. Він став енергійним захисником Православної Церкви, вів колосальне листування з представниками різних кіл суспільності - від князів Острозьких до львівських міщан Сідлярів, обмінюючись з ними літературними, церковними та науковими новинами.
Берестейська унія. Ініціятива до злуки з Римом вийшла від львівського єпископа Гедеона Балабана, огірченого постійними конфліктами з Львівським братством. Балабан скликає в Белзі 1590 році приватну нараду владик, на які брали участь, окрім самого Балабана, ще Кирило Терлецький, єпископ Туровський Леонтій Пельчицький, епископ Холмський Діонісій Збруйський. Балакали про становище православних єпископів і тут була вперша кинута думка про унію. Душею справи виявив себе Кирило Терлецький, до якого згодом пристав Інатій Потий (1541-1613). Сам митрополит Михайло Рогоза був згодом втянутий в справу унії, але він, як людина боязька і нерішуча, активної ролі не грав. Літом митрополит скликав до Берестя синод Православної Церкви, на якому мали обміркувати ріжні непорядки в церковнім житті й способи їх усунення. Нарада винесла кілька постанов: з’їздитись що-року на нараду, не вмішуватись владикам до справ чужих єпархій, розглянуто було те, що всі чотирі учасники Бельзької наради зібрались потаємно і окремо і склали декларацію про унію, яку Кирило Терлецький мав вручити королеві. В декларації підписані заявляли, що бажають мати своїм верховним пастирем Римського Папу, вимовляючи собі свої прежні обряди й увесь церковний порядок Православної церкви. Але тільки у 1590 році Кирило Терлецький доложив королеві. Жигижмонт II прийняв її дуже прихильно, обіцяв, що уніятів буде зрівняно з католиками в правах, і просив, щоб проект нарешті був оголошений до загального відома. Ще пару років справа велася конспіративно. Аж нарешті в кінці 1594 року остаточно вироблено акт про унію. Вихідним пунктом догматичних умов було взято Флорентійську унію 1439р. Духовенство й миряне мали підлягати в справах віри Римському Папі й приняти новий календар. Всі религійні обряди й церемонії Православної Церкви мали залишатися; остаточне вирішення справи причастія мав зробити Папа. Допускалися мішані шлюби й жонате духовенство. Уніятським єпископам дозволялося відправляти службу Божу в римо-католицьких костелах, а католицьким - в церквах. Уніятські єпископи мали дістати місця в сенаті і бути вільні від усяких податків. Уніяти допускалися до всіх державних посад нарівні з католиками. Митрополит Михайло Рогоза довго вагався чи пристати до унії, але нарешті став на боці прихильників унії. Чутки про неї дійшли до православного громадянства й викликали серед ньогу страшенну трівогу. Перший ударив на гвалт старий князь Острозький. Він був дуже обурений, що таку велику, всенародну справу робилося потайки. Володимирський єпископ Іпатій Потій, що був його приятелем з давніх часів, з сльозами, на колінях благав князя приєднатися до унії, але князь залишався непохитним і попередив, що буде боротися проти унії, проведеної в такий спосіб. Він звернувся у 1595р. з окружним посланіем до всіх православних, де називав єпископів зрадниками, закликав не йти за ними. Послання надруковане і розіслане, справило враження. Українська шляхта й віленське духовенство заложиа на своїм зїзді протест проти унії. Під впливом цієї агітації, відступив від унії перший ініциятор львівський владика Гедеон Балабан.