Самолет был удивительно "летучим" и из-за малых размеров - трудноуязвимым. Ki-27 был безоговорочно принят в 1938 году на вооружение Императорской армии Японии под обозначением "тип 97". Командование флота также проявило интерес к истребителю, но потребовало установления механизма складывания крыльев,что утяжелило бы конструкцию и на что Итокава принципиально не соглашался. В серийном производстве самолет был прост и почти идеально приспособлен к технологическим возможностям японских авиационных заводов.
Боевое крещение новый истребитель принял в боях с советской авиацией в районе реки Халхин-Гол.
Его появление было полной неожиданностью. Советская разведка не сумела распознать за типовым номером класс самолета,посчитав неизвестный "тип 97" тактическим бомбардировщиком Кавасаки Кi-32(тоже именовавшийся“тип 97”) c неубирающимися шасси, а не истребителем. Беспокойства в Управлении ВВС РККА, обескровленных массовыми репрессиями, эти сообщения не вызвали, и никаких предупредительных мер предпринято не было.
Первое столкновение И-16 (тип 10) и Ki-27 cоcтоялось 27 мая 1939 года, когда эскадрилья 22-го ИАП встретилась с 9 новыми японскими самолетами. Итог боя был ошеломляющим: с советской стороны были потеряны все 12 машин, - погибло два пилота -, а японцы лишились только одной! В тот же день 10 И-15 встретилось с 8 Ki-27. Результат был еще более драматическим. Пытаясь поразить противника на виражах,используя великолепные маневренные качества И-15, советские пилоты завязали бой на горизонталях,и к своему горькому изумлению превратились в мишени. На аэродром вернулся только один краснозвездый биплан, чтобы рассыпаться на посадке. Остальные были сбиты, погибло 5 летчиков. Японцы потерь не имели, и таким образом захватили господство в воздухе.С этого дня в официальных сводках новый японский истребитель стал именоваться И-97.
Для Сталина, очень ревниво относившегося к рекордам и неудачам советской авиации, эти события стали симптомом для сомнений в ее реальной боеспособности. Уже 28 мая состоялось совещание в ЦК ВКП(б),а 29-го в Монголию были командированы ассы-ветераны воздушных сражений в Испании и Китае во главе с комкором Яковом Смушкевичем. В район конфликта были направлены истребители И-15бис, И-153 "Чайка" и И-16 типа 24, оснащенные более мощным двигателем М-62 и вооруженными четырьмя пулеметами ШКАС калибра 7,62 мм. В район конфликта были направлены по одной эскадрилье новых самолетов: двухместных полуторапланов ДИ-6, И-16П, вооруженных двумя пушками ШВАК на крыльях и двумя синхронными пулеметами ШКАС,и И-16 с реактивными снарядами РС-82. Количественное соотношение самолетов сразу изменилось в пользу Советского Союза. Во главе 2-х полков И-16 были назначены соответственно Герои Советского Союза Григорий Кравченко и Иван Лакеев, еще формирующийся полк новейших И-153 должен был возглавить Герой Советского Союза Сергей Грицевец,- пока он отправлялся заместителем командира полка И-16,- а полк И-15бис- Евгений Степанов.
Это стало неприятным сюрпризом для японского командования, которое из-за малой производительности авиапромышленности Японии не могло противопоставить советской авиации необходимого количества Ки-27! А5М же были необходимы для палубной авиации, кроме того после воздушной войны в Китае их оставалось очень немного.
Смушкевич для успешного противодействия новым японским самолетам предложил ассам, Героям Советского Союза, применить предусмотренную Боевыми наставлениями ВВС РККА тактику взаимодействия скоростных монопланов с маневренными бипланами. Но бой 22 июня 1939 г., оказавшийся самым крупным воздушным сражением в межвоенный период, показал, что такая тактика себя не оправдывает: японцы сначала расправлялись с бипланами, а потом, используя преимущество в вертикальном маневре, вступали в бой с И-16. И хотя ТАСС вечером сообщило, что в воздушном бою было уничтожено 42 самолета: 31 японский и 11 советских, это вызывает сомнение у всех исследователей.
Соотношение потерь с обеих сторон всегда завышалось. Японские летчики Ki-27 заявили в отчетах, что сбили 1252 советских самолета.В приказе Народного комиссара СССР о присвоении 22-ому ИАП звания Краснознаменного говорилось, что его летчики сбили за время боев 262 японских самолета. Если некритично отнестись к японским цифрам, то окажется, что вся советская авиация в районе конфликта была полностью уничтожена, а если советским, то "сталинские соколы" только одного истребительного полка"смели с неба братской Монголии" все новые японские самолеты!
Но потери японской авиации были тем не менее чувствительными. Господство в воздухе, завоеванное так легко, было столь же быстро утеряно. Командование Императорской армии прибегло к проверенной в Китае тактике - уже в июле над Халхин-Голом появились закупленные в Великобритании после окончания первой мировой войны легкие бомбардировщики Эйрко(Де Хэвилленд) DH-4 и DH-9 и устаревшие И-95 (Кавасаки.92). Одновременно Итокава исследовал сбитые советские самолеты, чтобы узнать принципы установления пушек ШВАК на И-16 типа 24 и неповторимого механизма уборки шасси на ДИ-6.
После окончания конфликта Военное министерство Японии распорядилось постепенно прекратить производство Ki-27 на государственных заводах.В метрополии оно завершилось в середине 1940 г., когда начался выпуск модернизированного его варианта Ki-43 “Хаябуса” с убирающимися шасси и более мощным вооружением. Истребитель сохранил прекрасные,аэродинамически чистые, формы и дал прирост скорости до 520 км/час, сохранив маневренные свойства.И главное - летчики, до этого летавшие на Ki-27, осваивали “хаябусу” практически за несколько летных часов! К моменту снятия Ki-43 c вооружения их было построено около 10 тысяч.В период войны на Тихом океане американские летчики дали ему условное наименование “Оскар”.
После подписания мирного соглашения между советско-монгольской и японской делегациями 1620 Ki-27 было оставлено на вооружении ВВС Квантунской армии и авиации Манчьжоу-Го.
1718 этих истребителей были сведены в 3-ю воздушную армию(3 Hikoshidan) и годом позже направлены в Юго-Восточную Азию для завоевания французских колоний. Колониальная авиация правительства Виши, представленная разнотипными устаревшими самолетами Мюрро Mu-180 С2, Девуатин D-510 C1, Луар L-210 Cm1, Кертисс Н-75N с неубирающимися шасси, самыми современными из которых были Блок МB-151 C1, так как был вооружен 2 авиапушками, оказалась быстро разгромленной. Затем наступила очередь английского Сингапура, когда знаменитые “гладиаторы” не могли оказать сколько-нибудь серьезного сопротивления эскадрильям Ki-27, уступая им в маневренности, скорости и высотности. Командование РАФ не могло направить в Юго-Восточную Азию новых истребителей Супермарин “Спитфайр”, ограничившись громоздкими “харрикейнами”IB c двенадцатью крыльевыми пулеметами. В боях последние неизменно терпели поражения.
Авторитет этого замечательного истребителя временно упрочился, но весьма своеобразно: Ki-27 стал рассматриваться как признанный “король воздуха” в Индокитае и Малайе. По окончании военных действий они были размещены в оккупированных районах Китая и Юго-Восточной Азии. Здесь-то они встретились в 1942 году с новыми самолетами США, Австралии и Великобритании, бои с которыми уже год спустя вынудили японское командование перевести оставшиеся самолеты во второй эшелон и в учебные авиаотряды. Производство двухместного варианта самолета продолжалось до 1944 года на заводах Манцуи в Маньчжоу-Го, где было произведено 1379 учебно-тренировочных самолетов Ki-27 под наименованием Ki-79. Все японские летчики второй мировой войны прошли обучение именно на этих самолетах.
Делались попытки использовать Ki-27 в качестве штурмовиков, но из-за ничтожной бомбовой нагрузки и отсутствия бронирования к выполнению этих задач он вскоре перестал привлекаться. Чаще всего их применяли для перехвата воздушных караванов американских транспортных самолетов, летавших в Китай, над Бирмой и Аннамом (Вьетнамом), которых из-за больших расстояний не могли сопровождать истребители союзников. Преимуществом Ki-27 была способность взлетать и садиться на крохотных площадках в джунглях,которые японские саперы оборудовали очень быстро по маршруту полетов DC-3,хотя горючее приходилось доставлять туда на слонах и ослах. “Нейты” стали проклятием для пилотов-янки, доставлявших стратегические грузы войскам Объединенных наций.
Только с появлением дальних двухмоторных истребителей Локхид Р-38Е “Лайтнинг” и Нортроп Р-61А “Блэк Видоу” от такой тактики пришлось постепенно отказываться. Однако Ki-27 еще применялись и в 1944 году во время военно-морских сражений за Филиппины и даже использовались в качестве палубных с последующей посадкой на сухопутных азродромах архипелага, когда резерв подготовленных морских пилотов был исчерпан.
Своеобразный реванш за Халхин-Гол советская авиация взяла в августе 1945 года,когда СССР вступил в войну с Японией и осуществил вторжение на территорию Маньчжоу-Го, Китая и Северной Кореи. Никакого реального противодействия “лавочкиным” и “якам” изношенные Ki-27 оказать не могли и были или уничтожены на аэродромах, или захвачены. Наряду с другими японскими военными трофеями они были переданы Cоветским правительством безвозмездно Народно-освободительной армии Китая для борьбы с режимом Чан Кайши. В КНР они использовались в качестве учебно-тренировочных самолетов до 1954 года, пока не были заменены советскими Як-18.