К методике определения цитокинетических показателей эритроцитарного баланса крови птиц

Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина

Белгородский государственный университет

Изложен оригинальный способ определения функциональной активности костного мозга (эритроцитарного баланса) у птиц в физиологических условиях, который может быть использован в качестве интегрального теста при оценке адаптационных резервов системы эритрона в условиях действия экстремальных факторов. Это позволяет использовать предлагаемый способ в гематологии и экологии животных. Способ технически прост, экономичен и отличается высокой воспроизводимостью.

Введение

В настоящее время разработаны надежные методы определения отдельных периодов и всего генерационного цикла клеток [1, 4, 6]. Особый интерес представляет количественная характеристика резерва эритроцитов, возможность его мобилизации при различных состояниях организма. Современная методика подсчета костномозговой продукции эритроцитов, разработанная Е.Н. Мосягиной [3, 4] и усовершенствованная А.В. Илюхиным и соавт. [1], основана на определении продолжительности жизни эритроцитов по содержанию ретикулоцитов до и после инкубации пробы крови за определенный промежуток времени, поскольку равновесие системы эритрона в норме обусловлено двумя факторами: естественной гибелью эритроцитов и их костномозговой продукцией [6].

Метод не получил широкого распространения ввиду недостаточной его проработанности, высокой вариабельности и не всегда физиологически обоснованных различий цифровых данных, отражающих концентрации ретикулоцитов, определяемых при разных способах их окраски. Кроме того, анализ литературных источников показал достаточно редкую применимость метода при исследовании активности эритропоэза у птиц и низших позвоночных и, как следствие, слабую изученность обозначенного вопроса у этих групп животных. Применение общепринятого способа оценки интенсивности эритропоэза у других систематических групп животных не представляется возможным ввиду физиологоморфологических и биохимических особенностей эритроидного ростка кроветворения, а именно - различной скорости созревания, высокого разновозрастного полиморфизма клеток в периферическом русле и сохранения ядер у зрелых форм.

В связи с этим задачей исследования явились усовершенствование способа выявления ретикулоцитов и их возрастной классификации для функциональной диагностики системы красной крови по данным подсчета инкубированных ретикулоцитов птиц в физиологических условиях.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служила кровь, полученная из подкрыльцовой вены у здоровых половозрелых петухов кросса «Иза Браун». В качестве антикоагулянта использовали 3,8% цитрат натрия, 0,1 мл которого смешивали с 0,4 мл крови. Кровь с антикоагулянтом инкубировали в течение 4 ч [2] в биологическом термостате при 39°С. По истечении времени инкубации в пробирку отбирали 0,3 мл крови и добавляли 0,1 мл 1% раствора бриллиантового крезилового синего, приготовленного на физиологическом растворе (0,9% NaCl), продолжительность окрашивания при комнатной температуре составила 40 мин. Затем на чистых обезжиренных стеклах готовили мазки, которые фиксировали в метаноле, высушивали на воздухе и микроскопировали под иммерсией. Подсчет ретикулоцитов производили по степени их зрелости на 1000 эритроцитов, используя анализатор изображений «Видео-Тест-Мастер-Морфология» с программным обеспечением [5]. Диагностику функционального состояния системы красной крови производили по показателям эритроцитарного баланса, которые рассчитывали по формулам, предложенным А.В. Илюхиным и соавт. [1].

Результаты исследования

Используя предлагаемый способ, в крови птиц выявлены ретикулоциты в виде вытянутых эллипсоидов, окрашенных в бледно-зелёный цвет с ядром от светло-синего до фиолетового цвета, и синей сеточкой, имеющей различную конфигурацию в клетках разной степени зрелости: ретикулоциты 1 класса - сеточка заполняет всю цитоплазму и накладывается на ядро; ретикулоциты 2 класса - сеточка густо заполняет всю цитоплазму, при этом не накладывается на ядро; ретикулоциты 3 класса - сеточка расположена в основном вокруг ядра, иногда в виде эксцентрично лежащих клубков; ретикулоциты 4 класса - сеточка в виде нитевидных образований и отдельных включений, рассеянных по всей цитоплазме. Эритроциты - бледно-зелёного цвета с интенсивно синим ядром, без внутриклеточных включений (рис.).

Периферическая кровь петухов, увеличение х1600 1- ретикулоцит 1 класса, 2 - ретикулоцит 2 класса, 3 ретикулоцит - 3 класса.

Как видим, в условиях физиологической регенерации системы крови в связи с особенностью эритропоэза птиц, который при нормобластическом типе кроветворения предполагает поступление недозревших форм эритроцитов в периферическую кровь, где завершается процесс их формирования, присутствуют ретикулоциты третьего и четвёртого классов. Причём ритм регенераторных процессов системы эритрона (интенсивность эритропоэза) у отдельной особи будет зависеть от лабильности и адаптационных возможностей нервных структур, а также функционального резерва костного мозга птицы. Результаты показателей эритрокинетики представлены в табл.

Показатели эритроцитарного баланса крови птиц в физиологических условиях

№ птицы	^р, млн/мкл	Классы ретикулоцитов , %	^0, %	Np4, %	Ту р, ч	Ту эр, сут	N, тыс/ (мкл-сут)
		I - 0
3	5,2	II - 0	2,7	0,8	2,28	35,18	102433,2
3	5,2	III- 1,2	2,7	0,8	2,28	35,18	102433,2
		IV- 1,5
		I - 0
7	4,96	II - 0	2,6	0,4	1,48	23,71	137080,1
7	4,96	III- 1,8	2,6	0,4	1,48	23,71	137080,1
		IV- 0,8
		I - 0
9	5,55	II - 0,1	3,4	0,5	1,45	17,77	216440,6
9	5,55	III- 1,6	3,4	0,5	1,45	17,77	216440,6
		IV- 1,7
		I - 0
10	3,7	II - 0	2	0,7	2,64	55	46620,0
10	3,7	III- 0,9	2	0,7	2,64	55	46620,0
		IV- 1,1

Примечание: N эр - количество эритроцитов в 1 мкл крови; Np0 - количество ретикулоцитов до инкубации; Np4 - количество ретикулоцитов после 4 ч инкубации; Т У p - период полувыведения ретикулоцитов из пробы, обусловленный их созреванием; Т У эр - период полувыведения эритроцитов из кровотока; N - продукция эритроцитов.

Заключение

Показатель функциональной активности эритроидного ростка кроветворения является одним из важных диагностических тестов, применяемый при оценке интенсивности процессов физиологической и репаративной регенерации в системе крови, может быть изучен у различных систематических групп животных с использованием менее атравматичного для клеток, точного метода, позволяющего получать достоверные результаты и экономить время исследования.

Список литературы

Илюхин А.В., Бурковская Т.Е., Шафиркин А.В., Ключанская Н.В. Некоторые методические вопросы исследования эритроцитарного баланса по данным подсчета инкубированных ретикулоцитов // Космическая биология и авиакосмическаямедицина.-1982.-Т.16, № 3. - С. 86-88.

Ляпунова Е.А., Скоркина М.Ю. Цитокинетические показатели эритроцитарного баланса у птиц в физиологических условиях // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях. Сборник статей. - Томск: Изд-во ТГУ, 2001. - С. 31-33.

Мосягина Е.Н. Эритроцитарное равновесие в норме и патологии - М.: Медгиз, 1962. - 271 с.

Мосягина Е.Н., Владимировская Е.Б., Торубарова Н.А., Мызина Н.В. Кинетика форменных элементов крови. - М.: Медицина, 1976. - 270 с.

Патент на изобретение № 2227280 РФ. Способ определения ретикулоцитов в инкубированной крови птиц / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова. - по заявке № 2002119253 от 16.07.02 // БИПМ. - № 11, Ч. - 2004. - С. 557.

Илюхин А.В., Шашков В.С., Бурковская Т.Е., Зубеннова Э.С. Цитокинетика и морфология кроветворения при хроническомоблучении.-М.:Энергоиздат,1982. - 136 с.