М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова, А.С. Зеленцова
Белгородский государственный университет, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85
Впервые для эритроцитов лягушек определен мембранный резерв, рассчитан коэффициент резервной поверхности и выявлены влияния на эти важнейшие клеточные характеристики гипотонии. Изучены особенности клеточного ответа на адреналиновую, гипотоническую нагрузки и их сочетание. Показана стабилизирующая роль адреналина на мембрану, мембранные каналы и участие гормона в регуляции формы эритроцита.
Введение
Способность эритроцитов к регуляции объема имеет важное значение в реализации реологических свойств крови, обеспечении оптимального кислородного питания тканей и удалении метаболитов. В механизмах поддержания объема особая роль отводится процессам ауторегуляции и гормонам, способным модифицировать работу ионных переносчиков и изменять состояние цитоскелета [1], макромолекулы которого обеспечивают клетке высокую чувствительность к изменению объема [6], препятствуют свободному току воды в клетку [5], изменяют упруго-эластические характеристики мембран, что имеет значение для контроля транспортной активности.
Целью исследования явилось изучение влияния адреналина на резервные возможности мембран, регуляторные способности и устойчивость эритроцитов к гипоосмотическим нагрузкам.
Материалы и методы исследования
Исследования in vitro проведены на эритроцитах зимних лягушек Rana ridibunda Pall. Трижды отмытые эритроциты инкубировали в течение 15 мин при температуре 200C с адреналином (0,25 ммоль-л-1), а затем помещали в гипоосмотическую среду (0,2% раствор хлорида натрия). В ходе часовой экспозиции через каждые 30 с осуществляли видеорегистрацию клеток и компьютерный анализ в каждой контрольной точке, используя анализатор изображений с программным обеспечением «Видео - Тест - Мастер - Морфология». Измеряли максимальную и минимальную оси клетки; рассчитывали средний объем, толщину (высоту), площадь поверхности и коэффициент эксцентричности [3]. Биометрические индексы определяли по предложенному нами способу [2]. Контролем служили эритроциты, также погруженные в 0,2% NaCl, но не инкубированные с адреналином.
Результаты исследования и их обсуждение
Обработка клеток адреналином изменяет свойства мембраны. Через 30 с экспозиции при незначительном увеличении объема (на 1,9%; р>0,05) прирост площади поверхности мембраны составил 57,9% (р<0,001), но через 300 с коэффициент эксцентричности, объем, толщина и площадь поверхности в опытной пробе клеток были ниже на 3,2; 3,6; 0,3 и 3,3% (р>0,05) соответственно по сравнению с контрольной. Через 1 ч толщина эритроцитов уменьшалась на 6,1% (р<0,001) и увеличивались коэффициент эксцентричности, объем и площадь поверхности мембраны соответственно на 5,6% (p<0,05); 5,1 и 6,2% (р>0,05) (табл.).
Динамика морфометрических характеристик эритроцитарной популяции лягушек
| Время, с | Условия | s | V | T | S |
| 30 | контроль | 0,774+0,008 | 2365,369+68,039 | 5,484+0,075 | 375,996+7,61 |
| опыт | 0,778+0,008* | 2410,254+83,812 | 5,478+0,088 | 892,630+19,995*** | |
| 60 | контроль | 0,769+076 | 2880,807+71,994 | 5,893+0,070 | 1009,281+15,798 |
| опыт | 0,765+0,009 | 2732,055+70,271 | 5,790+0,068 | 972,953+16,742 | |
| 120 | контроль | 0,761+0,006 | 2968,709+79,407* | 5,994+0,070* | 1025,211+16,846* |
| опыт | 0,769+0,007 | 2700,043+87,314* | 5,738+0,070* | 964,045+20,924* | |
| 180 | контроль | 0,768+0,006* | 2770,656+75,629 | 5,818+0,075 | 978,647+18,636 |
| опыт | 0,741+0,009* | 2625,999+81,618 | 5,784+0,076 | 938,463+19,355 | |
| 300 | контроль | 0,762+0,006 | 2862,017+75,569 | 5,913+0,067 | 1001,665+16,462 |
| опыт | 0,752+0,008 | 2720,61+85,123 | 5,818+0,075 | 964,184+19,376 | |
| 330 | контроль | 0,766+0,007* | 2933,137+79,875* | 5,959+0,067 | 1016,66+17,157* |
| опыт | 0,746+0,007* | 2695,881+74,699* | 5,848+0,065 | 957,314+17,141* | |
| 3600 | контроль | 0,747+0,005* | 2712,727+68,052 | 5,858+0,065 | 964,285+15,106 |
| опыт | 0,765+0,005* | 2722,741+73,092 | 5,810+0,063 | 967,356+16,972 | |
| 900 | контроль | 0,727+0,007* | 2764,496+64,539 | 5,951+0,060* | 973,956+14,597 |
| опыт | 0,763+0,010* | 2653,445+79,794 | 5,722+0,074* | 952,656+18,314 | |
| 1800 | контроль | 0,725+0,010* | 2726,036+87,706 | 5,894+0,068* | 958,679+21,021 |
| опыт | 0,769+0,008* | 2589,895+102,867 | 5,650+0,083* | 932,621+22,793 | |
| 3600 | контроль | 0,720+0,009 | 3148,611+74,716 | 6,249+0,063 | 1059,6+16,034 |
| опыт | 0,763+0,016* | 3319,701+147,014 | 5,869+0,083*** | 1129,194+38,497 |
Примечание. е - коэффициент числовой эксцентричности, V - объём клетки, T - толщина клетки, S - площадь поверхности мембраны.
Статистическая значимость достоверности различия с исходными данными при - р < 0,05;
** - р <0,002; *** - р<0,001.
Экспозиция эритроцитов в течение часа в гипотонической среде отразилась на значениях биометрических индексов: через 30с резервные возможности мембраны (RVM) и регуляторные возможности клеток (RVK) в опыте и контроле отличались незначительно; коэффициент резервной поверхности (Крп) был выше в опытной пробе на 58,1% (p< 0,001). Через 150с RVM, RVK и Крп в обеих пробах были близки по значению. Через 180 с под влиянием адреналина прирост RVM составил 53,0%, Крп понизился на 17,5% (р<0,001), а RVM возросли на 94,1% (р<0,05). Тенденция роста RVM сохранялась в опытной пробе: через 270 с на 7,2%; 600 с - 8,4; 900 с - 10,0 и через 3600 с - на 48,8% (р<0,001). Изменения Крп находились в обратной зависимости от RVH: через 270 с экспозиции снижение Крп составило 14,8%, 600 с - 13,5; 900 с
9,3 (р<0,001) и через 3600 с - 5,44% (р>0,05).
Заключение
Адреналин, стабилизируя мембрану эритроцита, понижает проницаемость его для воды и снижает гипоосмотическую нагрузку. Вероятно, в условиях in vitro свободно-радикальные процессы сведены до минимума и, следовательно, структурно-функциональные изменения в мембранах не ведут к их дестабилизации. Начальное увеличение коэффициента резервной поверхности клеток, инкубированных с адреналином, обусловлено эффектом «растекания» гормонального действия вследствие изменения физико-химического состояния липидной фазы в сторону большей ее жидкостности, а следовательно, и подвижности как липидных, так и белковых молекул в мембране [4]. Увеличение Крп влечет за собой рост площади поверхности клеток; однако мембрана эритроцитов лягушек способна выдерживать относительно небольшое растяжение.
Список литературы
Орлов С.Н., Новиков К.Н. Регуляция объема клетки: механизмы, сопряженные клеточные реакции и патофизиологическое значение // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. - 1996.
Т. 82, № 8-9. - С. 1-15.
Патент на изобретение № 2268463 РФ. Способ оценки активности эритропоэза / Е.А. Липунова,
В.М. Никитин, М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцова - по заявке № 2004111098 от 12.04.04 // БИПМ. - № 2, Ч. III.
2006. - С. 1979.
Патент на изобретение № 2234701 РФ. Способ идентификации субпопуляций эритроцитарной системы / Е.А. Липунова, В.М. Никитин, Н.А. Чеканов, М.Ю. Скоркина.- по заявке № 2002134029 от 17.12.02 // БИПМ. - № 23, Ч. III. - 2004. - С. 573.
Перцева М.Н. Молекулярные основы развития гормонокомпетентности. - Л.: Наука, 1989. -
251 с.
Смирнова Е.А., Казачкина Н.Н., Ченцов Ю.С. Устойчивость разных типов клеток к действию гипотонии // Цитология. - 1987. - Т. 29, № 1. - С. 47-53.
Doctor B.R., Zhelev D.V., Mandel L.J. Loss of plasma membrane structural support in ATP-depleted renal epithelia // Am. J. Physiol. - 1997. - V. 272. - P. 439-449.