И в самом деле, в равновесии колебания невозможны. Но колебательные процессы осуществляются лишь до тех пор, пока системы неравновесны, пока не израсходована их свободная энергия. Пока концентрации реагентов неравновесны, колебательные режимы вполне возможны. Но это простое соображение долго не осознавалось даже очень образованными людьми. Поэтому, когда работавший в секретном учреждении военный химик генерал Борис Павлович Белоусов послал в 1951 г. в редакцию одного из журналов статью с описанием открытой им периодической реакции, статью ему вернули с обидной рецензией: такого не может быть!
А реакция, открытая Б.П. Белоусовым, замечательная – в растворе серной кислоты малоновая, лимонная, яблочная кислоты окисляются в реакции с KBrO3 в присутствии катализатора – ионов церия (или марганца, или железа). Если для большей наглядности в реакционную среду добавить комплекс железа и фенантролина, цвет раствора периодически изменяется от ярко-синего до красно-лилового и обратно. Глаз не отведешь! Наблюдающие эту реакцию даже дышать начинают невольно в такт изменениям цвета. Но рецензенты были настолько убеждены, что этого быть не может, что не захотели поставить несложный опыт. Зачем, когда и так ясно...
Ко времени открытия Б.П. Белоусова математическая теория колебательных реакций была уже создана (в 1910 г. Альфредом Лоткой). У нас в стране выдающиеся физики Л.И. Мандельштам, А.А. Андронов и их последователи создали общую теорию колебаний. Д.А. Франк-Каменецкий и И.Е. Сальников открыли и описали колебательные процессы в реакторах, когда происходят не только химические превращения, но и диффузия и передача тепла на стенках реактора. Все это могло служить моделями внутриклеточных колебательных процессов. Оставалось «немногое» – найти их в клетках.
Сообщения об открытии биохимических колебательных процессов начали появляться с конца 1950-х гг. (в том числе из нашей лаборатории). Однако первый бесспорно периодический биохимический процесс открыл выдающийся американский биохимик Бриттен Чанс.
Во всех клетках превращения энергии связаны с синтезом и гидролизом АТФ. Самый распространенный процесс, в котором в темноте и без кислорода образуется АТФ, – это гликолиз, когда происходит расщепление молекулы глюкозы на две молекулы молочной кислоты или на две молекулы этилового спирта и две молекулы СО2 (тогда этот процесс называется брожением). Гликолиз – это последовательность многих реакций, каждая из которых катализируется своим ферментом. Центральная реакция гликолиза (в ней фруктозо-6-фосфат превращается во фруктозо-1, 6-бифосфат) катализируется ферментом фосфофруктозокиназой. Вот в этой реакции и были обнаружены колебания скорости. Следовательно, и синтез АТФ должен был осуществляться с колебаниями скорости: то быстрее, то медленнее. И колебания были «вполне подходящие», с периодом порядка минуты, т.е. вполне годились на роль маятника биологических внутриклеточных часов.
Казалось, что механизм биологических часов – их маятник – найден. Однако вскоре наступило разочарование. Эти колебания в гликолизе идут лишь в особых условиях и, кроме того, сильно зависят от температуры. А часы от температуры зависеть не должны. В разных лабораториях продолжали поиск.
Гликолиз – это бескислородное окисление глюкозы, дающее всего две молекулы АТФ на одну молекулу превращенной в молочную кислоту глюкозы. А в митохондриях, осуществляющих внутриклеточное дыхание, образуется 34 молекулы АТФ на каждую окисленную до CO2 и H2O молекулу глюкозы. Вот если бы здесь был колебательный процесс, он должен был бы быть значительно более эффективным часовым механизмом.
Колебания в митохондриях были найдены – М.Н. Кондрашовой и Ю.В. Евтодиенко в лабораториях Института биофизики в Пущино. В ходе этих колебаний в митохондрии то входят потоки ионов калия, кальция или водорода, то выходят. Скорость поглощения кислорода митохондриями также периодически изменяется. Теперь найден механизм, точнее маятник, часов? К сожалению, нет. Все еще было не ясно – происходят ли эти колебания, как должно быть в часах, всегда, или только в определенных создаваемых в эксперименте условиях. И, опять же, выяснилось, что они сильно зависят от температуры.
Пришлось задуматься: следует ли искать механизм часов в процессах, обеспечивающих клетки энергией? Все больше данных свидетельствовало в пользу того, что часы идут в полном покое, когда энергия почти не расходуется, так же, как и при активной жизнедеятельности.
Пчел на зиму укрывают от морозов и света, они цепенеют в своих темных ульях. А часы у них «идут» всю зиму, и весной пчелы правильно определяют время суток, что необходимо им для правильного выбора направления полета к цветущим растениям за «взятком».
Охлаждаются и цепенеют при температуре, близкой к 0°С, повисшие вниз головой в темных пещерах летучие мыши. Проходит много месяцев до теплых летних ночей (все это время у них правильно идут часы), и в нужное время они вылетают на ловлю ночных насекомых.
Не сбиваются с нужной фазы и околосуточные периодические процессы у растений, помещенных на много недель в темноту при постоянной температуре. Внешне нет никаких проявлений хода часов, движения «стрелок» не видно. Но дайте краткую вспышку света, и окажется, что все это время часы правильно отсчитывали время: у фасоли листья будут опускаться или подниматься так же, как и у контрольных растений, бывших при нормальной смене дня и ночи (это упрощенная картина).
Часы идут даже при почти полной остановке метаболических процессов. В этих исследованиях важные результаты дает применение различных ядов–ингибиторов биохимических процессов.
Я уже упоминал морской одноклеточный организм Gonyaulax. Он светится ночью, следуя своим внутриклеточным часам. Всем известная зеленая эвглена, наоборот, ночью неактивна. Днем она активно плывет в сторону большей освещенности, проявляет положительный фототаксис. Свет необходим ей для фотосинтеза. Ночью, если направить на сосуд с эвгленами узкий луч света, они на него не реагируют, фототаксиса не проявляют. Наступление дня и ночи зеленая эвглена определяет по своим внутренним часам.
Если добавить в воду, где живут эти организмы, метаболические яды, останавливающие дыхание и гликолиз, жизнедеятельность их замирает, эвглены перестают двигаться, гониаулаксы не могут генерировать свет. Если перенести их в свежую среду, отмыть яды, жизнедеятельность восстанавливается. Но самое замечательное: оказывается, что все это время их часы шли вполне правильно, как будто бы клетки и не отравляли: после отмывания ядов они вовремя начинают испускать свет и вовремя проявлять способность к фототаксису. Но если добавить в воду яды, нарушающие процессы считывания генетической информации, например, актиномицин Д, препятствующий функционированию РНК-полимеразы – синтезу мРНК по матрице ДНК, – часы сбиваются, ход их нарушается. Эти наблюдения сделаны в 1960-х гг. американским исследователем Гастингсом.
Однако найти реакции синтеза белка в клетке с колебаниями скорости с периодом порядка секунд не удалось, а именно такие колебания нужны для обеспечения должной точности часов. И, вообще, после периода общего увлечения колебательными биохимическими процессами наступило (как обычно бывает) «охлаждение чувств». Колебательные режимы биохимических процессов стали казаться экзотикой, проявляющейся лишь в особых условиях. Но вот в последние годы интерес к этим процессам вновь пробудился.
Для самых разных клеток и тканей оказались характерными колебания концентрации ионов кальция с периодами порядка секунд–нескольких минут. Это взволновало исследователей, потому что именно ионы кальция являются универсальными регуляторами внутриклеточных процессов. Изменение их концентрации часто включает или выключает метаболические процессы – сокращение мышц, активность нервных клеток, определяет их электрическую активность.
Очень может быть, что колебательные изменения потоков кальция в клетке, периодические изменения проницаемости биологических мембран, периодические открывания и закрывания кальциевых каналов обусловлены специфическими физико-химическими свойствами – особенностями взаимодействия именно ионов кальция с фосфолипидными мембранами. Это, по-видимому, следует из замечательных опытов Г.Д. Мироновой в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН в Пущино.
Можно представить себе, что и взаимодействие соседних клеток осуществляется посредством колебаний концентрации кальция. А взаимодействие отдаленных друг от друга клеток, например в разных отделах головного мозга, вероятно, осуществляется посредством относительно низкочастотных электромагнитных колебаний, порождаемых колебаниями концентраций ионов (кальция, а затем натрия и калия) в отдельных мозговых структурах.
Но при чем тут синтез белка? Почему яды, нарушающие синтез белка, останавливают внутриклеточные часы? Это долго не удавалось понять. Успех здесь, как и во многих других областях современной биологии, был обусловлен изучением мутантов.
Существуют гены биологических часов
Более 50 лет назад К.Питтендрич начал изучение периодичности в жизни дрозофил. У разных видов разная суточная активность. Дрозофилы одних видов активны в утренние часы, других – в вечерние. Особенно четко суточная периодичность у них проявляется во время массового выхода взрослых мух из коконов.
К.Питтендрич создал замечательную школу исследователей. Мы обязаны этому ученому многими достижениями. В его лаборатории и было впервые установлено существование у дрозофилы гена биологических часов. В определенных местах хромосом есть ген per, определяющий циркадную периодичность. Мутации этого гена приводят к наследуемым изменениям хода часов. Аналогичные гены были обнаружены у низшего гриба нейроспоры и у крестоцветного растения арабидопсис.