Для доказательства суммарного характера определяемой величины АОА рассматривалось влияние восстановителей органической природы и их суммы на индикаторную систему.
Изучено влияние ряда индивидуальных восстановителей на систему Fe(III)–о-фенантролин оптимального состава. Для исследования выбраны широко распространенные в растительном сырье, материалах и используемые в пищевой промышленности антиоксиданты фенольной (галловая кислота, кверцетин, рутин, танин, гидрохинон) и нефенольной (аскорбиновая кислота, цистеин, глутатион) природы.
Аналитический сигнал для перечисленных органических соединений линейно зависит от концентрации вещества в широком диапазоне, но не стабилен во времени. Это приводит к увеличению зависимого коэффициента в уравнении регрессии при сохранении линейности в том же диапазоне (таблица 1). Величина тангенса угла наклона зависимости аналитического сигнала от концентрации восстановителя изменяется от 0,01 для глутатиона до 0,5 для галловой кислоты, что объясняется различной антиоксидантной способностью изучаемых восстановителей. По уменьшению антиоксидантной активности их можно расположить в следующей последовательности: галловая кислота > кверцетин > гидрохинон > аскорбиновая кислота > танин > рутин > цистеин > глутатион. Антиоксидантная активность обусловлена числом и расположением функциональных групп, способных легко отдавать атом водорода (–OH, –SH, –NH), наличием сопряженных двойных связей, а также пространственной структурой молекул. Так, кверцетин, который имеет две 3' и 4' гидроксильные группы в орто-положении кольца В и одну в 3 положении кольца С является более эффективным антиоксидантом, чем его гликозид рутин, активная 3 – OH группа которого замещена сахарным остатком (рутинозой). Кроме того, наличие гликозидного остатка приводит к изменению пространственного расположения молекулы, что также является причиной более низкой антиоксидантной способности гликозидов по сравнению с агликонами. Различие в восстановительной способности цистеина и трипептида глутатиона, по-видимому, также обусловлено пространственной структурой их молекул.
Таблица 1 – Зависимость аналитического сигнала от концентрации восстановителя во времени
| Восстановитель | τ, мин | Уравнения регрессии | R2 | Диапазон линейности,мкг/см3 |
| Аскорбиноваякислота | 30 | y = 0,2306x + 0,0037 | 0,9993 | 0,05 – 1,8 |
| 60 | y = 0,2465x + 0,0012 | 0,9996 | ||
| 90 | y = 0,2603x + 0,0013 | 0,9994 | ||
| 120 | y = 0,2713x – 0,0004 | 0,9991 | ||
| Танин | 30 | y = 0,1408x + 0,0028 | 0,9992 | 0,1 – 2,0 |
| 60 | y = 0,1807x + 0,0009 | 0,9997 | ||
| 90 | y = 0,2118x + 0,0008 | 0,9991 | ||
| 120 | y = 0,2305x + 0,0039 | 0,9987 | ||
| Рутин | 30 | y = 0,1006x – 0,0011 | 0,9993 | 0,1 – 2,0 |
| 60 | y = 0,1294x – 0,0016 | 0,9996 | ||
| 90 | y = 0,1535x – 0,0025 | 0,9997 | ||
| 120 | y = 0,1682x – 0,0024 | 0,9997 | ||
| Кверцетин | 30 | y = 0,3524x – 0,0018 | 0,9991 | 0,02 – 0,8 |
| 60 | y = 0,4390x – 0,0043 | 0,9987 | ||
| 90 | y = 0,4852x – 0,0046 | 0,9986 | ||
| 120 | y = 0,5156x – 0,0044 | 0,9983 | ||
| Галловаякислота | 30 | y = 0,5201x – 0,0026 | 0,9995 | 0,02 – 0,8 |
| 60 | y = 0,5817x – 0,0003 | 0,9991 | ||
| 90 | y = 0,6304x – 0,0003 | 0,9989 | ||
| 120 | y = 0,6642x + 0,0003 | 0,9986 | ||
| Гидрохинон | 10 | y = 0,3481x + 0,0105 | 0,9993 | 0,05 – 1,4 |
| 20 | y = 0,3517x + 0,0078 | 0,9993 | ||
| 30 | y = 0,3522x + 0,0063 | 0,9994 | ||
| 60 | y = 0,3530x + 0,0061 | 0,9995 | ||
| 90 | y = 0,3541x + 0,0059 | 0,9994 | ||
| 120 | y = 0,3552x + 0,0051 | 0,9992 | ||
| Цистеин | 30 | y = 0,0847x – 0,0075 | 0,9967 | 0,1 – 2,0 |
| 60 | y = 0,1141x – 0,0051 | 0,9992 | ||
| 90 | y = 0,1301x – 0,0024 | 0,9997 | ||
| 120 | y = 0,1394x – 0,0001 | 0,9998 | ||
| Глутатион | 30 | y = 0,0107x – 0,0016 | 0,9880 | 1,0 – 20 |
| 60 | y = 0,0168x – 0,0022 | 0,9921 | ||
| 90 | y = 0,0212x – 0,0024 | 0,9959 | ||
| 120 | y = 0,0243x – 0,0022 | 0,9978 |
Реальные объекты представляют собой довольно сложные по химическому составу системы, антиоксидантные свойства которых реализуются за счет суммарного содержания и действия восстановителей различной природы. Как правило, в растительных природных объектах и пищевых продуктах одновременно содержатся фенольные соединения, витамины, моно- и полисахариды, органические и аминокислоты. Кроме того, при оценке антиоксидантной способности необходимо учитывать не только природу и содержание восстановителей в исследуемом объекте, но и возможность их взаимного влияния (например, синергизм или антагонизм).
Для сравнения антиоксидантной активности различных восстановителей, их смесей и реальных объектов целесообразно выражать эту величину количеством вещества-стандарта, как принято при определении многих известных суммарных показателей. В качестве вещества-стандарта при определении АОА предложено использовать аскорбиновую кислоту (АК), поскольку установлено, что она по антиоксидантной способности занимает промежуточное положение среди изучаемых восстановителей.
Для подтверждения суммарного характера определяемой величины антиоксидантной активности изучено влияние модельных смесей, содержащих восстановители в различных соотношениях на индикаторную систему Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин. Расчет теоретической величины АОА, в пересчете на вещество-стандарт, проводили по уравнениям количественного соответствия, показывающим связь между количеством вещества-стандарта и восстановителя в условиях равной антиоксидантной активности. Экспериментальные значения АОА рассчитывали, подставляя величину аналитического сигнала модельной смеси в усредненное уравнение регрессии зависимости аналитического сигнала от количества аскорбиновой кислоты. Результаты анализа модельных смесей представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, экспериментально полученные и теоретически рассчитанные величины АОА хорошо согласуются. Несколько завышенные результаты для моделей, содержащих аскорбиновую кислоту, вероятно, можно объяснить проявлением ею синергетических свойств. Полученные данные показывают, что определяемая величина – антиоксидантная активность – результат совместного действия всех присутствующих в модельной смеси восстановителей.
Таким образом, определяемый показатель является интегральным и индикаторная система Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин может быть использована при разработке способа оценки суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.
Таблица 2 – Результаты анализа модельных смесей (τ = 60 мин)
(n = 6, P = 0,95)
| Количество компонентов в смеси, мкг | Теоретическое значениеАОА, мкг АК | Экспериментальное значение АОА,мкг АК | |||||||||
| введено | в пересчете на АК | ||||||||||
| АК | танин | рутин | кверцетин | цистеин | АК | танин | рутин | кверцетин | цистеин | ||
| − | 20 | 20 | 20 | − | − | 14,66 | 9,85 | 35,59 | − | 60,10 | 59 ± 5 |
| − | 10 | 10 | 10 | − | − | 7,33 | 4,92 | 17,79 | − | 30,04 | 27 ± 2 |
| − | 50 | 10 | 10 | − | − | 36,65 | 4,92 | 17,79 | − | 59,36 | 52 ± 5 |
| − | 10 | 50 | 10 | − | − | 7,33 | 24,63 | 17,79 | − | 49,75 | 51 ± 4 |
| − | 10 | 10 | 50 | − | − | 7,33 | 4,92 | 89,02 | − | 101,27 | 98 ± 8 |
| − | 30 | 10 | 10 | − | − | 21,99 | 4,92 | 17,79 | − | 44,70 | 38 ± 6 |
| − | 10 | 30 | 30 | − | − | 7,33 | 14,78 | 3,41 | − | 75,52 | 77 ± 9 |
| 20 | 20 | 20 | 20 | − | 20 | 14,66 | 9,85 | 35,59 | − | 80,10 | 97 ± 9 |
| 50 | 10 | 10 | 10 | − | 50 | 7,33 | 4,92 | 17,79 | − | 80,04 | 85 ± 10 |
| 10 | 50 | 10 | 10 | − | 10 | 36,65 | 4,92 | 17,79 | − | 69,36 | 74 ± 10 |
| 10 | 10 | 50 | 10 | − | 10 | 7,33 | 24,63 | 17,79 | − | 59,75 | 80 ± 11 |
| 10 | 10 | 10 | 50 | − | 10 | 7,33 | 4,92 | 89,02 | − | 111,27 | 129 ± 12 |
| 30 | 30 | 10 | 10 | − | 30 | 21,99 | 4,92 | 17,79 | − | 74,70 | 81 ± 8 |
| 10 | 10 | 30 | 30 | − | 10 | 7,33 | 14,78 | 53,41 | − | 85,52 | 108 ± 10 |
| 20 | − | − | 10 | 20 | − | − | − | 4,60 | 24,60 | 22 ± 2 | |
| 10 | − | − | 20 | 10 | − | − | − | 9,23 | 19,23 | 17 ± 2 | |
2 Разработка способа оценки антиоксидантной способности природных объектов
Проведенные нами исследования показали, что аналитические сигналы в индикаторной системе Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин меняются во времени в зависимости от концентрации как индивидуальных восстановителей и их смесей, так и реальных объектов. Это приводит к необходимости строгого контроля времени эксперимента, что делает его длительным, трудоемким, ухудшаются также метрологические характеристики анализа. Устранение этого недостатка и стабилизация аналитического сигнала требуют оптимизации условий протекания реакции. Для решения поставленной задачи рассматривались различные способы воздействия на реакцию, протекающую в системе: повышение температуры и введение в реакционную смесь реагентов, традиционно используемых для связывания ионов Fe+3 (фторида натрия, ЭДТА).
Влияние перечисленных параметров изучалось на примере реакции окисления аскорбиновой кислоты, концентрацию которой варьировали в установленных пределах диапазона линейности.
Исследование влияния температуры проводили в интервале 25 –60 °С. Нижняя граница диапазона соответствует нормальным условиям протекания окислительно-восстановительных процессов, а верхняя обусловлена неустойчивостью аскорбиновой кислоты при температурах выше 50 °С. Установлено, что при выдерживании реакционной смеси в течение 60 мин при температуре ~ 50 °С наблюдается стабилизация аналитического сигнала во времени. Это, вероятно, связано с более быстрым и полным протеканием реакции. Однако при анализе в этих условиях реальных объектов существенной стабилизации аналитического сигнала не наблюдается.