Таблица 2.
Результаты деятельности ВИР им. Н.И.Вавилова по изучению и регистрации генетических ресурсов растений с использованием белков семян в качестве маркеров
| Название рода | Число изученных н зарегистрированных: | Издано: | ||
| Видов | Сортов н дикорастущих популяции | Каталогов белковых формул | Метод, указании | |
| Пшеница | 20 | 4300 | 12 | 4 |
| Ячмень | 17 | 255 | 1 | 3 |
| Роясь | 7 | 180 | 1 | |
| Овес Тритикале | 191 | 215 500 | 1 | 3 |
| Этнлопс | 25 | 2080 | 4 | |
| Кукуруза | 1 | 410 | 2 | 1 |
| Рнс | 17 | 1776 | ||
| Сорю | 28 | 155 | ||
| Пыреи | 40 | 120 | ||
| Элнмус | 33 | 68 | ||
| Житняк | 4 | 25 | ||
| Колосник | 8 | 17 | ||
| Овсяница | 50 | 26 | 1 | |
| Плевел | 9 | 168 | 1 | |
| Ежа Мятлик Другие злаковые | 3 30 131 | 173 120 1260 | 1 | |
| Фасоль Другие бобовые Картофель | 88 118 44 | 102 510 300 | 1 | |
| Свекла | 13 | 300 | 2 | |
| КапустаЛук Амарант | 20 27 5 | 20918 | 105 | 1 |
| Подсолнечник Лен | 30 6 | 700 40 | 2 | 2 |
| Гречиха | 4 | 150 | ||
| Плодовые Ягодные Цитрусовые | 33 21 13 | 333 16047 | ||
| Куфня | 26 | 36 | ||
| Хохоба | 1 | 50 | ||
| Цитрусовые | 13 | 47 | ||
Распространенной методической ошибкой, встречающейся в работах зарубежных и отечественных исследователей является смешение понятий идентификация и дифференциация или различение сортов, генотипов и т.п. Исследователи, предлагающие новые методы идентификации сортов, образцов, гибридов и т.п., часто вообще не вдаются в подробности требований, предъявляемых к такого рода методам в государственных или иных структурах, имеющих дело с идентификацией и регистрацией сортов, семенным контролем. Идентифицировать сорт (генотип, гибрид, линию, клон) в том числе значит гарантированно узнать его с использованием данного метода в любой ситуации. Для этого надо иметь каталоги и базы данных, охватывающие генетическое разнообразие культуры или в целом вида (см. ниже). Надежный метод записи спектров ДНК и белков (номенклатура компонентов спектра ММ) - принципиальный элемент любой стандартной системы идентификации и регистрации сортов по ММ [3,4,7-13]. Только в этом случае возможен обмен данными между контролирующими лабораториями независимо от их принадлежности (генные банки, коммерческие и государственные контрольно-семенные лаборатории и т.п.)[14].
Во ВННИР им. Н.И.Вавилова еще в начале 70-х годов В.Г.Конаревым, И.П.Гаврилюк и Н.К.Губаревой была разработана номенклатура компонентов электрофоретических спектров глиадина [3-6]. Принципиальное отличие предложенной номенклатуры состоит в том, что она базируется на результатах обстоятельного изучения внутривидовой изменчивости маркерного белка в мировой коллекции. В дальнейшем эта идея была реализована для запасных белков семян большинства важнейших культур (Табл.2). Используя эталонный спектр, составленный для культуры можно записать спектр любого сорта, биотипа, образца в виде так называемых белковых формул [4,14]. В первую очередь это было осуществлено для большого числа родов злаков, включающих важнейшие зерновые и кормовые культуры (табл.2). Был составлен единый эталонный спектр пролами-нов злаков триб пшеницевых (Triticeae Dum.), овсовых (Aveneae Dum.), тимофеевковых (Phleeae Dum.) и мятликовых (Роеае R. Br.). Этот спектр был основан на изучении спектров пролами-нов десятков тысяч отдельных семян (генотипов), включающих все возможные позиции этого белка. Кроме того, для каждой культуры был составлен рабочий эталонный спектр проламина [4,19].
Полиморфизм запасных белков семян бобовых - глобулинов был использован в сортовой идентификации зерновых бобовых культур - гороха, сои, вики, люпина, кормовых бобов, а также кормовых бобовых трав (клевер, люцерна, донник). У бобовых как и у ряда других двудольных растений для целей идентификации были привлечены 7S (вицилиноподобные) и 11S (легумино-подобные) глобулины [4,19]. В настоящее время во ВНИИР им. Н.И.Вавилова сортовая идентификация по спектрам запасных белков (глобулинов) осуществляется у многих других двудольных растений, в частности подсолнечника, свеклы, капусты, салатных растений, рапса, горчицы, гречихи и многих других (табл.2) [4,19]. Так по результатам сравнительного анализа 150 представителей различных видов капустных (Brassica L.) был составлен эталонный спектр круциферина (глобулина) для представителей данного рода, включающего важные кормовые, овощные и технические культуры. По такому спектру записываются формулы круциферина видов, сортов, линий, гибридов представителей этого рода [20].
Аналогичным образом был составлен суммарный (эталонный) спектр гелиантинина (глобулина подсолнечника). Спектр состоит из всех возможных позиций полипептидов этого белка, обнаруженных к настоящему времени при анализе внутривидовой изменчивости [4,19], что позволяет идентифицировать и регистрировать все внутривидовое разнообразие подсолнечника, включая сорта, линии, гибриды [21]. Номенклатуры электрофоретических спектров глиадина были разработаны также специалистами Франции, Канады и ряда других стран [10-12]. Генетическая номенклатура спектров и компонентов проламинов пшеницы и ячменя была предложена и успешно развита в работах А.А.Созинова и его учеников [7-9].
Во ВНИИР им. Н.И.Вавилова генофонд сортов и дикорастущих образцов документируется в виде белковых формул. Полученная информация сохраняется в виде каталогов формул (табл.2) и компьютерных баз данных формул. Для надежной идентификации и регистрации сортового генофонда ведущих зерновых культур и их дикорастущих сородичей в большинстве случаев достаточно электрофореза запасных белков. Иногда приходится использовать другие типы белков, например глютенины или ингибиторы протеолитических ферментов [4, 6, 19].
Принципиальной является проблема соответствия понятий статуса сорта в общепринятом смысле и с использованием молекулярных маркеров. Для корректного подхода к вопросу предварительно проводятся специальные исследования на большом объеме сортов и на внутривидовом разнообразии диких сородичей. Наиболее сложно дело обстоит с перекрестноопыляющимися культурами, поскольку каждый сорт или образец представляет собой сложную смесь различных генотипов, которым соответствуют разные типы спектра белка или ДНК. Такая сортовая или дикорастущая популяция может быть идентифицирована и зарегистрирована по наличию определенных типов спектра и частоте их встречаемости [4,19]. После сформирования баз данных (компьютерных либо каталожных) открываются реальные возможности использования белковых или ДНК-маркеров для решения ряда практических вопросов коллекций, например, некоторых проблем интродукции или пополнения коллекции (табл.1). На основании сравнительного анализа информации заложенной в каталоги или в базы данных в виде белковых формул, а также информации, полученной при анализе вновь поступившего семенного материала, может быть сделан предварительный вывод о степени оригинальности последнего (с целью предотвращения дублирования образцов). Многолетний опыт ВИР показывает, что такая информация, как правило, в дальнейшем подтверждается так называемыми традиционными методами [2].
Для оценки степени генетических различий между образцами, например, образцами разного географического происхождения, или культурными и дикими формами широко используются ДНК- и белковые маркеры. Во ВНИИР им. Н.И.Вавилова мы использовали ПДРФ-маркеры (RFLP) в изучении генетической дифференциации ячменя. Однако, для анализа обширных коллекций метод ПДРФ достаточно трудоемок. Здесь удобнее использовать более простой и достаточно чувствительный RAPD-анализ. Такие работы, в частности, были проведены ВИРом совместно с Национальным Институтом Сельскохозяйственных Исследований (Япония) на образцах дикого и культурного ячменей из коллекции ВИР, а также на ряде других коллекций [22]. Целью работы была оценка взаимоотношений между различными формами культурного и дикого ячменей по полиморфизму фрагментов ДНК, амплифицированных в полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами (RAPD). Полученные результаты позволили разделить изученные сорта и местные популяции на три основные группы, которые, очевидно, отражают основные тенденции в эволюции и географическом распространении культурного ячменя. Обнаружено соответствие выделившихся групп и кластеров культурного ячменя мировым центрам разнообразия культурных растений (генцентрам), выявленным Н.И.Вавиловым, а также современной эколого-географичес-кой классификации ячменя [22].
Аналогичный экспериментальный подход был применен для выяснения структуры коллекций гексаплоидных пшениц. Методом RAPD-анализа изучена степень родства между образцами гексаплоидных пшениц разных эколого-географических групп (более 400 образцов из коллекции ВИР). Исследования проводились также в том числе и в связи с возможностью маркирования генотипов с высоким уровнем зимостойкости, а также в связи с отработкой технологии создания стержневых коллекций. Результаты координатного и кластерного анализа этих данных продемонстрировали, что все изученные образцы гексаплоидных пшениц представляют собой единый генный пул, который делится на четыре большие группы. Обнаруженное деление находится в полном соответствии с эколого-географической классификацией предложенной Н.И.Вавиловым [23]. Удалось идентифицировать праймеры, позволяющие выделять группы образцов с ценными адаптивными свойствами (например, холодостойкость). Это свидетельствует о перспективности данного подхода к анализу мировой коллекции как исходного материала для селекции по важнейшим признакам. Подобные исследования с использованием ДНК-маркеров проведены недавно сотрудниками ВИР на коллекциях овса, проса, вики, риса. Использованию белковых маркеров для решения вопросов внутривидовых связей посвящено большое число публикаций, в том числе сотрудников ВИР [4,7,10,11,19,24].